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作者：闫西刚 贡志刚 兰青 王晓东 黄强作者单位：苏州大学附属第二医院神经外科， 江苏 苏州 215004
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# K" W- S7 g$ Q) I, W7 R) g5 p 【摘要】 目的 探索大鼠骨髓基质干细胞 （BMSC） 体外分离、培养及纯化的合适实验条件，并探讨其在体外定向诱导分化为神经元样细胞的可行性。 方法 通过密度梯度离心法从成年大鼠骨髓中分离出BMSC，而后通过贴壁培养法培养及纯化，观察其生长特性；对纯化后的BMSC 使用碱性成纤维生长因子 （bFGF） 和表皮生长因子 （EGF） 进行定向诱导分化，并进行免疫细胞化学鉴定。 结果 体外培养的BMSC 传4代后，纯度最高，可达 （95.23 ± 3.06）%；其诱导分化7 d后，（75.43 ± 7.63）%的细胞表现为β-TubulinⅢ阳性的神经元样细胞，（33.01 ± 6.73）%的细胞则为GFAP阳性的胶质细胞。 结论 BMSC 在体外培养条件下生长良好，经bFGF和EGF诱导后可大量分化为神经元样细胞和神经胶质细胞。 ; _! J; U/ g' Q: }- d5 n
【关键词】骨髓基质干细胞 细胞分离 细胞分化 神经元
) H' [( w: c7 p In vitro isolation, cultivation and differentiation of rat bone marrow stromal cells: N2 f/ Q8 ~' K2 \
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YAN Xigang, GONG Zhigang, LAN Qing, et al
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: y( p( ]# D" e' I Department of Neurosurgery, Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, China
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3 {# h0 G/ D% V9 H8 Z" m+ V Abstract:ObjectiveTo establish an optimal protocol for the isolation, cultivation and purifying of rat bone marrow stromal cells (BMSCs), and explore the feasibility of inducing BMSCs to differentiate into neuron-like cells in vitro.MethodsBMSCs were isolated from adult rats by means of gradient centrifugation, purified by anchoring culture, and observed for their growth characteristics. After the administration of bFGF and EGF, the induced differentiation of BMSCs was evaluated by immunocytochemistry.ResultsAfter 4 passages, the highest purification of BMSCs was achieved as (95.23±3.06) % in vitro. After 7 days of induced differentiation with bFGF and EGF, the yields of β-Tubulin Ⅲ positive cells and GFAP positive cells were (75.43±7.63) % and (33.01±6.73)% respectively.ConclusionThe BMSCs could be cultured and purified well in vitro, and could also be induced to differentiate into neuron-like cells and glial cells by bFGF and EGF." W l# I" N1 y9 i* v$ O
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Key words:bone marrow stromal stem cells;cell separation;cell differentiation;neurons
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近年来的研究表明，成年动物骨髓中的骨髓基质干细胞 （BMSC） 在特定诱导剂的作用下，在体外可以诱导分化为神经元样细胞[1]。由于BMSC可直接从自体骨髓腔中抽取或从松质骨中获得，取材方便，来源充足，无免疫排斥反应，且增殖能力强，可在体外大量培养、扩增和分化，因此有可能是用于中枢神经系统疾病自体移植治疗的理想细胞资源。本研究试图对BMSCs的取材、培养、纯化以及定向诱导分化进行探索，摸索出较佳的实验条件，从而为细胞移植治疗奠定良好基础。
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1材料与方法6 y. T. B9 i: Q% I
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1.1动物与材料动物：成年近交系Wistar大鼠 （＞36代），雌雄不限，体质量约300 g/只 （中国科学院上海实验动物中心提供）。试剂：DMEM、F12 （Gibco公司），胎牛血清 （FBS，杭州四季青公司），淋巴细胞分离液 （密度为1.077 g/L，上海试剂二厂），表皮生长因子 （EGF，Peprotech公司），山羊血清 （PAA公司），碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）、Triton-X-100、联脒二苯吲哚 （DAPI） （Sigma公司），兔抗CD44抗体 （武汉博士德生物工程有限公司），小鼠抗兔CD45单克隆抗体 （Caltag公司），兔抗β-Tubulin Ⅲ抗体 （Corance公司），兔抗GFAP抗体 （DAKO公司），Alexa Fluor 488标记羊抗兔IgG （Molecular Probes公司），Cy3标记羊抗小鼠IgG （Dianova公司）。仪器： CO2细胞培养箱 （ESPEC BNA-311）、倒置相差显微镜 （XDS-1B）、激光共聚焦显微镜 （Ziess LSM410）。
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1.2方法4 }0 N4 |: _; f6 `6 Z2 [4 Q
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: {. x# K# b4 G. C0 o 1.2.1细胞取材：大鼠乙醚麻醉后经脱颈处死，无菌条件下取出股骨和胫骨，剪断一侧骨端，用注射器吸取含20% FBS的DMEM-F12培养液，从另一端插入注射器冲洗3次，然后反复吹打骨髓细胞，制成单细胞悬液。将此悬液以1∶1比例，轻轻顺离心管壁加在淋巴细胞分离液上，1 000 rpm/min离心10 min，离心后液体由上至下分为稀释液层、有核细胞层、分离液层及管底的红细胞层，吸取液面交界处的有核细胞层，用培养液洗涤2次后计数。1 105/ml接种于内含20% FBS的培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内孵育。
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$ O. g! A+ `+ w( @/ R% t 1.2.2细胞培养：在细胞接种3 d后进行全量换液，以后每3 d全量换液1次，以去除造血干细胞所造成的干扰。连续培养2 ～3周后，当细胞达80%融合时，以0.25%胰酶消化后传代。通过反复传代，对BMSC 进行扩增和纯化。倒置显微镜下连续观察细胞的数量及形态变化。
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3 v; C& }4 {" d% k( m/ W 1.2.3BMSC 的鉴定：在培养BMSC的24孔培养板中，加入4%的多聚甲醛，固定30～45min；PBS漂洗2次，加入含有4%山羊血清和0.1% Triton-X-100的PBS，静置30 min；去除液体，加入含有0.1% Triton-X-100和一抗的PBS 4 ℃过夜。一抗为兔抗CD44抗体 （1∶25） 和小鼠抗兔CD45抗体 （1∶50）。PBS漂洗5次，再加入含有4%山羊血清、DAPI （1∶10 000） 和相应二抗的PBS，室温下孵育1 h。二抗为羊抗兔Alexa Fluor 488抗体 （1∶150） 和羊抗小鼠Cy3抗体 （1∶200）。PBS漂洗3次。在激光共聚焦显微镜下对培养物进行观察、拍照并计算CD44、CD45阳性细胞的比例。; O) p$ X7 n+ B3 d/ H4 i, u
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1.2.4绘制细胞生长曲线：计数原代至7代的BMSC 中CD44、CD45阳性细胞：每孔光镜下随机取5个非重叠视野，分别计数阳性细胞数和总细胞数，每项目重复做3孔，取平均值计算阳性率。分别绘制CD44、CD45阳性细胞生长曲线。
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9 ~% z5 ^6 w" T' g 1.2.5BMSC 诱导分化：细胞传至第4代后，接种入24孔培养板，待细胞生长达60%~80%融合时，再进行诱导分化。在无血清的培养基中加入30 ng/ml bFGF 20 ng/ml EGF，连续诱导7 d。阴性对照组不加任何诱导剂。9 B+ W% X% g T3 u
5 l( x) s1 E& W1 o 1.2.6免疫细胞化学染色及阳性细胞计数：分别对诱导1～7 d的细胞行幼稚神经元标记物β-TubulinⅢ、星形胶质细胞标记物GFAP染色，具体方法同前述的CD44、CD45染色，仅一抗改为兔抗β-TubulinⅢ抗体 （1∶600） 或兔抗GFAP抗体 （1∶600）。阴性对照组以PBS （PH 7.4） 分别代替β-TubulinⅢ及GFAP抗体。每孔光镜下随机取5个非重叠视野，分别计数阳性细胞数，每项目重复做3孔，取平均值计算阳性率。 b! X6 H) L& R9 C
" m: D$ V l% @: ~ 1.2.7统计学分析：所有数据经SPSS10.0统计软件包进行统计分析，各组数据以均数±标准差表示，采用两两样本均数t检验，以P ＜0.05表示差异有统计学意义。# G7 B% g3 d1 y6 M
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2结果" ]# v4 V4 j5 s& J
( D) v) q, h) c- t6 S$ C 2.1BMSC 的培养、传代及纯化原代细胞在接种24 h后即有细胞贴壁，以后贴壁细胞数目不断增加，且有小的突起伸出，呈单个或多个细胞聚集。随着时间的增加，贴壁细胞体积不断增大，突起逐渐变长，部分细胞的突起相互连接。此时大部分细胞胞体大而扁平，小部分细胞胞体小而呈梭形、圆形或不规则形，细胞折光性强，可见细胞核及核仁。通过换液，未贴壁的细胞可逐渐被清除，贴壁细胞得到纯化，原代细胞渐出现向成纤维样细胞趋化的表现。原代的BMSC 生长缓慢，至14 d左右时达70%～80%融合，此时细胞密度较大，大部分细胞呈长梭形的成纤维细胞样，细胞密集生长处呈现旋涡状、菊花状、辐射状。传代后的细胞生长迅速，3～4 d即可长满瓶底。通过传代，细胞得到进一步纯化，至3代以后，细胞形态趋于一致 （图1）。7代后，细胞形态变宽大，生长速度明显减慢，传代周期延长，细胞内颗粒状物质增多。
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2.2BMSC 免疫表型鉴定BMSC 经CD44、CD45抗体染色后可见大量呈绿色的CD44阳性细胞 （图2）以及少量CD45阳性细胞。其中CD44抗原是BMSC 表面标志性抗原之一，而CD45抗原是造血干细胞表面抗原之一。原代至7代的BMSC 各代细胞CD44阳性率依次为： （51.85 ± 6.51）%、（79.97 ± 11.07）%、（89.75 ± 2.02）%、（92.61 ± 1.77）%、（95.23 ± 3.06）%、（92.46 ± 9.09）%、（90.86 ± 6.13）%、（86.96 ± 4.56）%；CD45阳性率依次为：（43.64 ± 5.40）%、（19.97 ± 8.14）%、（2.38 ± 4.23）%，BMSC 传至第2代以后已检测不出CD45阳性细胞。以上数据显示，随着传代的增加，BMSC 的纯度随之增加，至第4代时纯度达到最高 （图3）。
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4 G/ T- R# u' i( x1 v- o: o; `6 y' e 2.3BMSC 的诱导分化 （图4）诱导24 h后，可见部分BMSC 出现胞体收缩变圆，胞质向核周收缩，突起增多，变细变长，细胞折光性增强，少数细胞的突起相互连接。48 h后，出现形体改变的细胞进一步增多，部分细胞的突起伸出二级或三级分支，可见轴突、树突及胞体的锥样改变，部分细胞的突起相互连接，在局部形成网状结构。72 h后大部分细胞发生形态改变，伸出类似神经元样的突起，突起之间相互连接，形成网络样结构。4 d后细胞发生形态改变的趋势减缓，7 d后几乎已无细胞发生形态改变。
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4 _7 _2 p- y9 [/ m0 R; g9 | 2.4BMSC 诱导分化后的免疫细胞化学鉴定随着诱导时间的延长，β-TubulinⅢ阳性细胞以及GFAP阳性细胞数逐渐增加（图5），至第7天时达到最高，分别为 （75.43 ± 7.63）%和 （33.01 ± 6.73）% （图6），二者有显著差异 （P ＜0.005）。
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7 O; |, q' f" A BMSC 的研究是近年来的热点，其在特定的培养条件下可分化成多种细胞，如间充质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞、神经元和胶质细胞等[1-3]。但是BMSC在骨髓中的含量不高，约占有核细胞的0.001%～0.01%；因此，如何进行分离、纯化、体外培养及扩增对于有效开发、利用BMSC显得尤为重要。目前用于分离纯化BMSC的方法有4种：全骨髓贴壁培养法[4]、密度梯度离心法[5]、荧光激活细胞分选术 （FACS）[6]和磁珠分离法 （MACS）[7]。由于尚未发现特异性很强的表面标志分子，因此很难应用FACS和MACS进行分离培养。单独使用贴壁培养法或密度梯度离心法均不能达到很好地分离、纯化BMSC 的效果。本实验采用了贴壁培养法和密度梯度离心法相结合的方法：先用淋巴细胞分离液将大部分造血细胞分离出去，再通过贴壁培养换液去除悬浮生长的造血细胞，取得了较好的效果，所培养的BMSC 传至第4代时，CD44抗原表达阳性的细胞达到细胞总数的 （95.23 ± 3.06）%，提示培养细胞中的BMSC 纯度较高。3 U( t% [& |7 `2 q6 e) J9 W
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近年来的研究表明：BMSC 向神经元样细胞分化是通过一系列信号转导途径实现的[8]。多种因素 （包括细胞质对细胞核的影响，相邻细胞间的相互作用及细胞所处的外环境，如细胞因子、激素等） 对细胞的定向分化起到调节作用，其中神经营养因子的作用尤为关键。目前，BMSC 向神经元样细胞的体外诱导分化方法主要有两种：抗氧化剂诱导法[9]和神经营养因子诱导法[1]。两种方法的差异在于，前者诱导分化快，但诱导后的细胞存活时间短，24 h后分化了的细胞大多死亡；后者诱导分化效率高，而且诱导后细胞的生长状态明显好于前者[10]。本实验采用了bFGF和EGF联合诱导的方法，BMSC 在7 d内形态上向神经元方向改变很多，免疫组化也证实β-TubulinⅢ阳性细胞逐渐增多，7 d时可高达75%左右，而7 d后细胞形态不再有大的变化。. ?* r, t& y( n8 q! d# `
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' w: B5 m2 j: n' v; d& ~ 综上所述，本实验有可能为细胞移植治疗中枢神经系统疾病提供丰富的细胞资源，并且也为何时收获细胞用于移植提供了确凿的依据。
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发表于 2009-3-3 12:37
发表于 2009-3-19 15:59
