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作者：潘国栋 黄永章， 郭凌郧， 唐俊明， 孔 霞， YANG Qinglin， 王家宁 . x* U' E* B5 ~5 @& Z+ G
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, c9 o) E& d1 A9 P; k: Y% Q9 A 【关键词】心肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞
- K% r& u7 E( q L7 D9 U [摘要]目的： 构建并鉴定心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体（MHC-EGFP），该基因只在心肌中特异性表达。 方法： 设计5’和3’分别具有SalI/HindⅢ酶切位点的EGFP引物，聚合酶链反应法（PCR）从pLEGFP质粒中扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的cDNA，插入pGEM-T Easy载体表达盒，构建pGEM-EGFP，SalI/HindⅢ双酶切后回收729 kb片断，插入经相同酶切的含5.5 kb心肌特异性α肌球蛋白重链启动子的pNC26质粒，构建pMHC-EGFP。连接产物转化感受态DH5α，挑选克隆，PCR扩增鉴定，重组质粒经NotI酶切，回收7.2 kb MHC-EGFP表达盒。分离培养小鼠心肌细胞与骨骼肌成肌细胞。MHC-EGFP表达盒通过脂质体法分别转染心肌与骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜观察转染细胞是否出现绿色荧光，以鉴定MHC-EGFP表达盒是否具有表达特异性。结果： EGFP cDNA正确插入pNC26质粒中αMHC启动子3’端。成功转染MHC-EGFP表达盒的心肌细胞出现绿色荧光，而转染的骨骼肌成肌细胞无荧光出现。结论： MHC-EGFP表达盒具有心肌特异性表达特性，为进一步监测干细胞向心肌分化研究奠定基础。4 R: ^8 c0 X8 o3 ]0 M- y
[关键词]心肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞
4 D) }# f1 t! {7 aConstruction and Identification of alpha-Cardiac Myosin Heavy Chain Promoter-Driven Enhanced Green Fluorescent Protein Expression Vector1PAN Guo-Dong, 1HUANG Yong-Zhang, 1GUO Ling-Yun, 1TANG Jun-Ming, 1KONG Xia,2YANG Qing-Lin, 1WANG Jia-Ning(1Institute of Clinical Medicine, Renmin Hospital, Yunyang Medical College, Shiyan, Hubei 442000, China; 2Cardiovascular Research Institute, Morehouse School of Medicine, Atlanta, Georgia 30310, USA)
* g, I! B4 ]' j! A) M2 Y( b0 ?Abstract: Objective To construct and identify the cardiac-myosin heavy chain promoter (MHC) -driven enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression vector (pMHC-EGFP), which solely expresses EGFP in cardiomyocytes. Methods EGFP cDNA primers were synthesized with forward primer and reverse primer containing SalI and HindⅢ, respectively. EGFP cDNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR), added single deoxyadenosine at 3’ ends, and subcloned into pGEM-T easy vector to construct pGEM-EGFP. The fragment of 729 bp from SalI/HindⅢ-digested pGEM-EGFP was subcloned into pNC26, a plasmid carried 5.5 kb MHC promoter, to construct pMHC-EGFP. The expression cassette of 7.2 kb MHC-EGFP was recovered with low melting point agarose electrophoresis. Mouse cardiomyocytes and skeletal muscle myoblasts were isolated and cultured in vitro. MHC-EGFP expression cassettewas transfected into cardiomyocytes and myoblasts, respectively. EGFP expression was observed under fluorescent microscope. Results EGFP cDNA was successfully inserted into the 3’ ends of MHC promoter. The green fluorescence could be observed in transfected cardiomyocytes, but not in transfected myoblasts. ConclusionMHC-EGFP expression cassette can be specifically expressed within cardiomyocytes, which provides a basis to monitor the differentiation of stem cells into cardiomyocytes.
) U/ q4 J9 G* j# `1 M2 a4 y. WKey words:Cardiac-specific; Myosin heavy chain; Promoter; Enhanced green fluorescent protein; Stem cells
" _5 j! v+ P \ 近年来日益兴起的大量干细胞研究证实，胚胎或成体间充质干细胞在一定条件下可以分化为心肌样细胞，为心脏疾病的治疗带来了希望。然而这些心肌样分化的干细胞是否具有成年心肌的收缩和传导功能，目前研究还相当缺乏。这是因为通过免疫组织化学或细胞化学染色判断干细胞分化，需要先对细胞进行固定处理，不能在活细胞状态下观察干细胞的心肌分化。本研究将心肌特异性α肌球蛋白重链（alpha-myosin heavy chain, MHC）启动子与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）连接，构建在心肌中特异表达的报告基因系统，使之用于在活细胞状态下观测判断干细胞的心肌分化，为深入进行干细胞的心肌分化研究奠定基础。
I0 E8 C- W3 @( v. K. {/ e: B1材料与方法
' R. R! o2 y7 `$ K0 ?1.1材料限制性内切酶SalI、HindⅢ、NotI以及200 bp DNA ladder和Lambda DNA/HindⅢ markers购自华美生物工程公司；Taq聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTP和dATP购自Promega公司；pfu DNA聚合酶购自New England Biolabs公司；Lipofectamine 2000阳离子脂质体购自Invitrogen公司，DMEM培养基购自Gibco公司；新生牛血清购自四季青生物材料有限公司；包含5.5 kb MHC启动子的pNC26质粒由Morehouse School of Medicine提供；包含EGFP cDNA的pLEGFP-C1质粒购自Clontech公司；pGEM-T Easy Vector系统购自Promega公司；5’端加有SalI和HindⅢ酶切位点的EGFP cDNA PCR上下游引物（上游：5’-GTC GAC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC -3’，下游：5’-AAG CTT TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG -3’）由北京赛百盛基因技术有限公司合成。+ D. O6 b0 m. x' h5 A9 `+ K
1.2方法! b8 |' \0 [: M& ]
1.2.1pMHC-EGFP构建策略（图1）4 F+ U/ n" Z3 M6 @3 [
1.2.2EGFP cDNA扩增：以pLEGFP-C1为模版，20 mmol/L的上下游引物各5 μl，pfu DNA聚合酶1 μl，10×buffer 5 μl，10×dNTP 5 μl，加双蒸水至总反应体积50 μl。进行聚合酶链（polymerase chain reaction, PCR）反应：起始变性94 ℃ 5 min，然后执行94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30次循环，最后72 ℃延伸10 min。低熔点琼脂糖凝胶电泳回收729 bp EGFP cDNA片断。, Y' y, ?. ] ~1 ]9 N6 q
1.2.3“T”连接反应：参照本所已建立的方法[1-2]，将回收纯化的729 bp PCR产物，加入10×buffer 5 μl，10×MgCl2 5 μl，2 mmol/L dATP 2 μl，Taq酶2 μl，加双蒸水至总反应体积50 μl，72 ℃孵育30 min。回收纯化加“A”后的EGFP cDNA片断（731 bp），加10×T4 DNA连接buffer 5 μl，pGEM-T Easy vector 0.5 μl，T4 DNA连接酶1 μl，加双蒸水至总反应体积10 μl，室温连接3 h。将连接产物转化DH5α，涂布含氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB琼脂培养基上培养12 h，蓝白筛选，挑选白色单菌落接种于含氨苄青霉素（100 μg/ml）的TB培养基中培养12 h，提取质粒酶切鉴定。重组质粒命名为pGEM-EGFP。8 ?, z8 W" L; L, N6 ]' }$ c8 {
1.2.4MHC-EGFP构建：将pGEM-EGFP和pNC26分别用SalI/HindⅢ双酶切，前者回收729 bp片断，后者回收线性化pNC26片断。两种片断充分混匀，在T4 DNA连接buffer 5 μl，T4 DNA连接酶1 μl，总体积10 μl体系中室温连接4 h。连接产物转化DH5α，涂布含氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB琼脂培养基上培养12 h，挑选单菌落接种于含氨苄青霉素（100 μg/ml）的TB培养基中培养12 h，提取质粒酶切鉴定。重组质粒命名为pMHC-EGFP，经NotI酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收7.2 kb的MHC-EGFP表达盒。* Z4 f9 G# W# Z0 e* @
1.2.5心肌细胞分离培养：取1 d龄新生昆明小鼠10只，无菌条件下取出心脏，PBS漂洗，剪碎，加入0.125%胰酶 0.02% EDTA消化液，37 ℃水浴消化10 min，静置后弃上清。继续消化组织团块，每次加入消化液3~4 ml，37 ℃水浴消化10 min，静置后收集上清，2倍体积含15%新生牛血清DMEM中止消化，重复3~4次。直至组织团块基本消失。将收集的消化液2 000 rpm离心，弃上清，含15%新生牛血清DMEM重新悬浮细胞，以1×107/ml接种于25 cm一次性塑料培养瓶，于37 ℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养2 h，使大多数心肌成纤维细胞贴壁。转移尚未贴壁的心肌细胞至另一培养瓶中继续培养。8 R0 ~2 W* b3 K, b0 c T0 V; ]
1.2.6骨骼肌成肌细胞培养：参考姚启盛等[3]方法，取成年昆明小鼠，无菌条件下分离双下肢肌肉，PBS漂洗，剪碎，加入dispase 2.4 u/ml,collagenase 1%,CaCl22.5 mmol/l消化液37 ℃水浴消化30 min，2倍体积含15%新生牛血清DMEM中止消化，以1×107/ml接种于25 cm一次性塑料培养瓶，于37 ℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养。- L8 c& C T$ C& h$ _! \3 s
1.2.7MHC-EGFP表达盒转染：上述心肌或骨骼肌成肌细胞接种2 d后，进行MHC-EGFP基因转染。将纯化的5 μg MHC-EGFP与等体积Lipofectamine 2000阳离子脂质体50 μl充分混匀，静置10 min后，细胞培养液中加入脂质体DNA混合液，孵育6 h后换为普通完全培养液继续培养，荧光显微镜（Nikon TE2000, Japan）观察细胞是否出现绿色荧光。
2 g$ X; N/ s# O/ z& c8 a 2结果
& ^$ Q {3 L; P: e" C2.1EGFP cDNA扩增以pLEGFP-C1为模板，经EGFP上下游引物PCR扩增后，2%琼脂糖凝胶电泳可见特异性729 bp扩增片断（图2略）。, D1 e' R! i e s/ }3 ~
2.2“T”连接反应扩增产物EGFP cDNA通过Taq聚合酶加“A”，T4 DNA连接酶与pGEM-T easy vector连接，转化DH5α感受态，挑选单菌落扩增，提取质粒后，经SalI和HindⅢ双酶切，2%琼脂糖凝胶电泳可见729 bp片断（图3略）。
V) x9 u+ f' r- g) M- G4 ]2.3pMHC-EGFP构建pGEM-EGFP和pNC26经SalI/HindⅢ双酶切，T4 DNA连接，转化DH5α感受态，挑选单菌落扩增，提取质粒后，经SalI和HindⅢ双酶切，2%琼脂糖凝胶电泳可见729 bp片断（图4略）。
9 h) }; E, v( `$ L2.4心肌细胞分离培养细胞接种后，经差速贴壁去除大多数成纤维细胞，贴壁细胞呈现心肌特有多边形或杆状形态。接种10 h后观察到大部分细胞出现自发性搏动。7 k6 }( K( ~1 t1 V
2.5骨骼肌成肌细胞培养贴壁细胞呈扁平、多突起形态，胞浆极其丰富，生长迅速,符合成肌细胞特征。: X |2 Y+ y# z7 q! M4 k
2.6MHC-EGFP表达盒转染及鉴定心肌细胞经脂质体介导MHC-EGFP表达盒转染后48 h，部分细胞绿色荧光（图5）。而基因转染的骨骼肌成肌细胞始终未观察到绿色荧光细胞。/ t& S( n+ v. `9 U; V
3讨论
3 E) w8 ~* Q3 E0 n5 Q 心肌α肌球蛋白（cardiac-myosin）是成年心肌特有的结构蛋白，由2条重链（α-MHC）和2条轻链（α-MLC）组成。α-MHC启动子结构于1991年明确[4]。pNC26质粒由pBlueScriptⅡ SK 质粒插入5.5 kb α-MHC启动子和0.6 kb人生长激素poly A构建而成。紧邻α-MHC启动子3’含有SalI和HindⅢ酶切位点。为了使EGFP cDNA定向克隆于α-MHC启动子3’端的SalI和HindⅢ位点，本研究采用两端分别带有SalI和HindⅢ的EGFP cDNA扩增的上、下游引物，将PCR产物扩增后加入单个“dA”，利用TA互补原理，可以方便地将EGFP cDNA插入到pGEM-T easy vector，避免了PCR产物直接酶切不能被酶切位点识别的缺陷。本研究成功地将EGFP cDNA插入到pNC26质粒的SalI和HindⅢ位点上，将pMHC-EGFP经NotI酶切后释放出了含α-MHC启动子、EGFP cDNA和poly A的EGFP表达盒。将该表达盒转染培养的小鼠心肌细胞后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，而骨骼肌成肌细胞未见绿色荧光，说明MHC-EGFP表达盒在心肌细胞中特异性表达。MHC-EGFP心肌特异性表达盒对于监测干细胞向心肌分化的研究具有重要意义。Takahashi等[5]证实，转染MHC-EGFP表达盒的胚胎干细胞在心肌分化早期就可以观察到绿色荧光，其敏感性和准确性都明显优于传统的免疫组织化学和细胞化学染色。因为MHC启动子驱动的EGFP cDNA只有在心肌细胞中才能表达。这一特点可以方便地用来监测各种因素诱导的干细胞向心肌细胞的分化，尤其是可以在活细胞状态下观察，使进一步对这些细胞进行功能研究以及进行分选纯化成为可能。本研究为进一步研究各种因素诱导的干细胞向心肌细胞的分化奠定了基础。; k/ U: x. c+ f$ B1 b2 m
[参考文献]
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& ?: {2 V. U; T7 }' M [2]董晓,王家宁,黄永章,等.pET15b-EGFP原核表达载体构建及其表达和纯化[J].郧阳医学院学报,2005,24(6):321-325./ I+ h4 Y' W J8 w
[3]姚启盛,叶章群,陈丛波,等.Dispase 在成年鼠骨骼肌干细胞纯化中的价值[J].郧阳医学院学报,2004,23(6):336-338.
2 Z' U/ @$ A' ^- @ [4]Gulick J, Subramaniam A, Neumann J, et al. Isolation and characterization of the mouse cardiac myosin heavy chain genes[J]. J Biol Chem,1991,266(14):9 180-9 185.; j; l% ]! C7 O9 {
[5]Takahashi T, Lord B, Schulze PC, et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes[J]. Circulation,2003,107(14):1 912-1 916. % W4 r# R' @! \* h8 t2 B
(1郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所，湖北十堰442000；
4 ~5 Q8 r2 J/ z" @) b2Cardiovascular Research Institute, Morehouse School of Medicine,Atlanta, Georgia30310, USA) |
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发表于 2009-3-3 12:37
发表于 2015-7-15 12:10
