骨髓增生异常综合征患者的间充质干细胞具有免疫抑制作用 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:36 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：张翼鷟　达万明  黄文荣高春记  郭博作者单位：解放军总医院血液科, 北京 100853 . `1 d$ Y- v; t4 s) k: p

   , s$ J1 M  f2 t3 ]2 B

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      ; ~- m2 w8 f# b2 E" d; D" z

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      【摘要】  　　本研究探讨骨髓增生异常综合征（MDS）患者间充质干细胞（MSC）的免疫抑制作用。采集MDS患者的骨髓标本，分离、培养和扩增MSC，观察细胞形态并进行表型鉴定；将不同数量的细胞加入单相混合淋巴细胞反应（MLR），检测MSC对自体及采自健康供者的异体外周血淋巴细胞 (PBL)增殖水平的影响。结果发现：3×103-1×105个源于MDS患者的 MSC可将自体PBL的增殖抑制到最大反应的（66.9±20.1）%-（30.2±5.9）%, 将异体PBL的增殖抑制到最大反应的（56.6±14.7）%-（20.5±9.7）%,与培养自健康供者MSC的抑制作用相比，差异无统计学意义(P>0.05)。结论: MDS患者的MSC和健康者的MSC具有相似的免疫抑制功能。   d2 V' T' d' E
      【关键词】骨髓增生异常综合征；间充质干细胞；免疫抑制; 混合淋巴细胞反应+ ^1 t9 e3 l- `2 \: U3 \  i; N
   　　Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Derived from Patients with Myelodysplastic Syndrome Possess Immunosuppressive Activity* q4 m6 K1 ^* k! T0 G3 b6 t2 u2 D

ZHANG YiZhuo, DA WanMing, HUANG WenRong, GAO ChunJi, GUO Bo7 U0 u; m& w$ ]: A# t

Department of Hematology, PLA General Hospital, Beijing100853, China8 x& r# l' i9 v
. o2 w  i' w/ ?8 o
AbstractThis study was aimed to evaluate whether mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from patients with myelodysplastic syndrome possess immunosuppressive effect. MSCs from bone marrow samples of MDS patients were isolated, cultured and expanded. MSCs were morphologically analyzed and their immunophenotype were determined by flow cycometry.Various amounts ofMSCs were addedinto oneway mixed lymphocyte reaction. MSCs from MDS patientswere tested for their ability to suppressin vitro proliferation of autologous and allogeneic peripheral blood lymphocytes (PBLs).The results showed that 3103-1105 MSCs from MDS patients could inhibit autologuousPBLs proliferation to (66.9±20.1)%-(30.2±5.9)% of maximal response,as well as inhibitallogeneic PBLs proliferation to (56.6±14.7)%-(20.5%±9.7)% of maximal response, as compared with inhibitory ability of MSCs from healthy donors, there was no significant difference (P>0.05). It is concluded MSCs from patients with myelodysplastic syndrome also possess immunosuppressive activity.* }6 w5 U3 d/ s* p% f% x9 i
0 X# m8 x  u; i  Z
Key wordsmyelodysplastic syndrome; mesenchymal stem cell;immunosuppression; mixed lymphocyte reaction( S+ o6 U+ L. z' _% f, x+ F
, [7 l( z4 n0 o6 n6 u- A1 c! `4 y  u
J Exp Hematol 2007; 15(2):302-305" ^  X( B' T8 [( q1 U$ w

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome, MDS）是造血系统的一组异质性克隆性疾病，迄今为止其发病机理尚未完全阐明。有研究［1，2］发现，在部分MDS病例中，异常免疫机制介导的造血干细胞损伤是其发病的关键；环孢菌素A（CsA）等免疫抑制剂治疗的良好效果进一步支持了这一观点。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC），又称骨髓基质细胞（marrow stromal cells，MSC），是骨髓造血微环境的重要组成部分［1，2］。近年来，关于MSC与免疫系统的关系、MSC对淋巴细胞增殖反应的影响等已开展了不少研究［3-5］，但关于MDS患者的间充质干细胞的免疫调节能力如何，是否与MDS发病相关等的报道尚未见到，我们就此做了有限的研究，报道如下。
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材料和方法2 c% ?6 n( U$ {5 |" o

研究对象

8例未经治疗的MDS患者的骨髓标本，依照2000年WHO诊断标准7例为难治性贫血（RA），1例为难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB),其中男6 例，女2例，中位年龄52(34-78)岁。髂骨穿刺获得穿刺物10 ml, 标本加肝素抗凝。同时采集8例健康供者的骨髓标本作为对照。4 @! z2 F# \3 D9 Q  x, ~

间充质干细胞的分离及培养: K7 X2 B2 z/ x  y" N: Z* ]

骨髓标本置于1.077 g/ml的Ficoll分离液（BiochRom公司产品），400g离心20分钟，收集单个核细胞，用PBS洗2次，以（20-40）104／cm2的密度接种于75 cm2培养瓶中，培养体系为Dexter完全培养液（Invitrogen公司产品），置37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中培养。72小时后去除非贴壁细胞，每周换液2次。待细胞生长至瓶底90％融合时，以0.25%的胰蛋白酶消化, 1∶3传代［6，7］。& x* [: u" w; ^. A. z3 p9 t' T
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间充质干细胞的形态、表型及成骨分化功能鉴定

光学显微镜下观察细胞形态，利用流式细胞术对培养细胞进行表型测定，以终浓度为0.1 μmol/L的地塞米松，10 mmol/L的β磷酸甘油和0.05 mmol/L的维生素C（Sigma 公司产品）组成的诱导体系诱导成骨分化， 3周后检测碱性磷酸酶(ALP)的活性［6，7］。
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MDS患者的MSC对自体淋巴细胞增殖反应的影响
* ?3 e/ X: T- P0 }' i  r
从新鲜肝素抗凝的MDS患者外周血中获得外周血淋巴细胞（PBL）。将1105 PBL与经60Co照射（总剂量为30 Gy）的等量健康者（第三者）PBL加入96孔板内。在反应的当天加入不同数量MDS患者的MSC，细胞数分别为1105、3104、1104、3103。每组剂量设置3个复孔，对照孔不含MSC。培养体系为含有10％FBS，2 mmol/L谷氨酰胺和1％青链霉素的RPMI 1640培养液（Gibco公司产品）。共培养5天后, 最后18小时加入1 μ Ci/well ［3H］TdR（Amersham 公司产品），多头细胞收集器收集细胞，β闪烁仪测定样品cpm值（counts per minute），每组取平均值。以对照孔的平均cpm值为100％最大反应，最大反应百分数＝各反应的cpm值／100％反应的cpm值。对照组为获得上述8例健康供者外周血淋巴细胞（PBL）。将1105PBL与经60Co照射（总剂量为30 Gy）的等量健康者（第三者）PBL加入96孔板内（n=10），加入上述不同数量级的健康供者MSC，检测其对MLR的影响。

MDS患者的MSC对2份混合培养的正常人异体淋巴细胞增殖反应的影响
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从新鲜肝素抗凝的健康人（第四者）外周血中获得外周血淋巴细胞（PBL）。将1105PBL与经60Co照射（总剂量为30 Gy）的等量健康者（第三者）PBL加入96孔板内。在反应的当天加入不同数量MDS患者的MSC，细胞数及培养方法等均同上。共培养5天后, 最后18小时加入1 μCi/well ［3H］TdR（Amersham 公司产品），用多头细胞收集器收集细胞，β闪烁仪测定样品cpm值。对照组中检测培养自健康供者骨髓的MSC对上述混合淋巴反应的影响。* K! e) B: C+ H. y' J. D

统计学处理
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以Studentt检验比较样本之间的统计学差异, P
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结果
1 l4 T+ e) D8 ^2 N
MDS患者MSC的形态及表型鉴定
. _$ h* D. J' s) Q
从MDS患者骨髓中获取的单个核细胞接种于培养瓶中, 72小时后去除悬浮细胞即可见贴壁细胞，呈典型的成纤维细胞样，2-3周后出现致密的贴壁层。经流式细胞仪检测，细胞表达CD73（SH3）、CD105（SH2）及CD90(Thy1)，而CD34、CD45等造血细胞标记为阴性，符合MSC的形态学和表型特点。对上述细胞进行成骨诱导，形态由纺锤形变为扁平形，3周后检测ALP表达呈强阳性，而对照组（不加诱导物）ALP表达为阴性。
' }9 ^' l) R/ @& ^. c7 ]
MDS患者MSC对自体淋巴细胞增殖的抑制作用
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在 MDS 患者的自体 PBL 增殖反应体系中加入1105、 3104、1104、3103个MDS患者的MSC, 可将单相混合淋巴细胞反应抑制到最大反应的（30.2±5.9）%、（35.4±11.5）%、（45.6±9.8）%、（66.9±20.1）%,与相同数量的健康者骨髓MSC的抑制作用相比差异无统计学意义(P>0.05), 后者可将PBL的增殖抑制到最大反应的（25.4±3.8）%、（29.7±7.5）%、（40.8±10.5）%、（53.6±8.5）% (图1)。
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MDS患者MSC对异体淋巴细胞增殖的抑制作用

在以健康人外周血淋巴细胞设置的单相混合淋巴细胞反应中加入不同数量MDS患者的MSC, 发现后者对异体淋巴细胞的增殖也具有抑制功能,可将增殖抑制到最大反应的（20.5±9.7）%、（31.2±12.6）%、（46.8±8.6）%、（56.6±14.7）%, 与相同数量的采自健康者骨髓MSC的抑制作用相比较，差异无统计学意义(P>0.05), 后者可将异体PBL的增殖抑制到最大反应的（26.7%±6.1）%、（28.1±6.4）%、（37.3±8.3）%、（57.8±11.9）%(图2)。: ^" C3 \: D3 h1 g$ g6 O
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讨论! _' S4 Y. X3 q* D( q; T! W$ _

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome, MDS）主要表现为骨髓无效造血、外周血细胞一系或多系减少，临床易转化为急性白血病。由于发病机制尚未完全探明，故该病的诊断、分型及治疗等方面仍存在诸多悬疑。在过去的数十年中，MDS的发病率呈增长趋势，特别是在50岁以上的人群中,多数预后差，尚无十分满意的治疗方案。因此，深入探讨MDS的发病机制，寻找更为有效的治疗手段显得尤为迫切。目前国内外多数研究认为，造血干/祖细胞的过度调亡是MDS发病的关键性因素［8］，骨髓微环境中TNFα等抑制性细胞因子表达的上调［9］、新生血管形成［10］及DNA甲基化［11］等可能与该病的发病有关。+ h4 W, [5 j/ d5 p) J6 {
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部分MDS病例在临床表现上与再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）及阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemaglobinuria, PNH）有相当的重叠以及三者之间的相互转化，这提示免疫介导的造血干／祖细胞的损伤可能参与致病。免疫抑制剂如抗胸腺细胞免疫球蛋白（ATG），环孢菌素A（CsA）等免疫调节治疗的成功有力地支持了这一推测。进一步的体外实验发现，通过免疫抑制治疗可消除由淋巴细胞介导的CFUGM的生长抑制，表明细胞毒性T细胞（CTL）的功能异常导致了对造血干／祖细胞的抑制［12］。
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骨髓造血基质是造血系统的重要组成部分，通过产生和分泌细胞因子及细胞外基质对造血细胞的生成和分化发挥重要作用。近年来的一些研究表明，MDS患者的骨髓基质细胞存在着量和质的异常，但骨髓造血微环境在MDS的发病中到底扮演了何种角色、是“旁观者”还是其中重要的致病因素，目前尚无定论。间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC），也被称为骨髓基质细胞（marrow stromal cell, MSC）, 是造血基质的重要组成部分。我们的初步研究以MDS患者的MSC为滋养层，接种脐血单个核细胞进行体外造血支持实验，结果显示MDS组的细胞总数和CFUGM计数显著低于正常对照组，但其增殖能力却较正常者无异［6］。故我们推论，MDS患者骨髓基质的异常可能参与MDS的发病机理。% V' r! f; ]6 O4 v8 i0 B

MSC对免疫的负调控作用是近来移植领域研究的一个热点。体外实验发现，在同种异体混合淋巴细胞反应中加入MSC会导致增殖显著的抑制。这一发现促进了临床组织器官修复及骨髓移植后GVHD防治的进展［13］。/ r! [7 ~  B1 T  o$ }
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MDS患者的MSC是否也具有免疫抑制作用，该作用与其发病是否相关，这类研究目前尚未见报道。我们对此进行了初步的研究，结果发现无论将上述细胞加入到以MDS患者自身外周血淋巴细胞（PBL）设置的单向混合淋巴细胞反应体系中，或是异体MLR中，均可明显抑制PBL的增殖, 并且呈剂量依赖性，与从健康供者骨髓中获取的MSC的免疫抑制作用相比，差异无统计学意义。因此，我们认为，MSD患者的骨髓间充质干细胞也与健康人骨髓MSC同样具有一定的免疫抑制作用。我们曾以实时定量RTPCR法筛选了一些细胞因子、化学趋化因子如IL10、SDF1等，研究了它们在MDS患者MSC中的表达，发现SDF1的表达水平显著高于正常人［7］。有关更为深入的相关机制研究我们正在进行中。
      【参考文献】
1Molldrem JJ，Caples M, Mavroudis D, et al.  Antithymocyte globulin for patients with myelodysplastic syndrome. Br J Haematol, 1997;99:699-705

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2Jonasova A, Neuwirtova R, Cermak J, et al. Cyclosporin A therapy in hypoplastic MDS patients and certain refractory anaemias without hypoplastic bone marrow. Br J Haematol, 1998; 100: 303-309& Y2 B2 V/ a! G4 _3 C0 c9 }0 ?
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3Djouad F, Plence P, Bony C, et al.  Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favours tumour growth in allogeneic animals. Blood，2003；102:3837-3844

4DiNicola M, CarloStella C, Magni M, et al. Human bone marrow stromal cells suppress Tlymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood， 2002; 99:3838-3843( r& y. \/ x5 Z# a

5 z- i1 w  ]9 c/ h" F' u$ u. }! g
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5张翼鷟，Fouillard L, Alain Chapel A等. 源于近端股骨的间充质干细胞具有免疫抑制作用.中华医学杂志，2005；85：2780-2784
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3 `+ z/ P6 f  }" c3 g3 u8 ?
6张翼鷟，达万明. 骨髓增生异常综合症患者间充质干细胞的生物学特性及体外支持造血的实验研究. 中国实验血液学杂志，2005；13: 839-842

7张翼鷟,达万明.骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞SDF1基因的表达.中国实验血液学杂志，2006；14：218-284

8 f3 a" A5 w# u+ A7 T1 q

8FloresFigueroa E, GutierrezEspindola G, Montesinos JJ, et al. In vitro characterization of hematopoietic microenvironment cells from patients with myelodysplastic syndrome. Leuk Res, 2002; 26: 677-686

  o3 Z* U& C4 n* j; R
: M/ A4 L% t" x# h; O
9Battett J, Saunthararajah Y, Molldrem J. Myelodysplastic syndrome and aplastic anemia: distinct entities or diseases linked by a common pathophysiology? Semin Hematol, 2000; 37:15-29

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10Raza A, Meter P, Dutt D, et al. Thalidomide produces transfusion independence in long standing refractory anemias of patients with myelodysplastic syndromes. Blood, 2001; 98:958-965; J8 j2 G0 v, y# @; {# {- F

! g: E$ R1 ^. n

11Daskalakis M,  Nguyen TT, Nguyen C, et al. Demethylation of  a hypermethylated P15/INK4B gene in patients with myelodysplastic syndrome by 5Aza2′deoxycytidine (decitabine) treatment. Blood, 2002; 100: 2957-2964

# h: N, ~* ^3 w8 o3 A; A: \- ^

12Molldrem JJ, Jiang YZ, StetlerStevenson M, et al. Haemological response of patients with myelodysplastic syndromes to antithymocyte globulin is associated with a loss of lymphocytemediated inhibition of CFUGM and alterations in Tcell receptor Vβ profiles. Br J Haematol, 1998; 102: 1314-1322

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13Frassoni FL, Bacigalupo A, Gluckman E.  Expanded mesenchymal stem cells (MSC), coinfused with HLA identical hematopoietic stem cell transplants, reduced acute and chronic graft versus host disease:  a matched pair analysis ［abstract］. Bone Marrow Transplant，2002； 29: 75

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