兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外构建组织工程骨的实验研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:35 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：李大鹏　沈铁城　黄永辉　左华　邵顺秀作者单位：1.江苏大学医学院，江苏  镇江 212013；2.江苏大学附属医院骨科，江苏镇江 212001

   ! Z& C; _% Z# m$ ~/ u# O) g% u


         7 A' F6 H" p1 v6 L6 ]
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      【摘要】  　　目的：研究兔骨髓间充质干细胞（marrowderived mesenchymal stem cells，MSCs）与纳米晶胶原基骨修复材料（nanohydroxyapatite/collagen，NHAC）体外复合培养的结合程度，以及构建组织工程骨的可行性。方法：分离兔MSCs体外培养、纯化，取第3代MSCs与NHAC体外复合培养，第5，10 d后扫描电镜（SEM）观察二者复合程度。结果：兔MSCs贴壁生长，增殖速度快，生长曲线符合Logistic生长曲线；兔MSCs与NHAC体外复合培养，在第5，10 d进行扫描电镜观察，发现10 d时粘附于NHAC上的MSCs细胞数（38.52±7.21）明显高于5 d时粘附的细胞数(21.28±4.70)，P8 j0 W5 y# O1 @) D& _
      【关键词】骨髓间充质干细胞　纳米晶胶原基骨修复材料　组织工程骨　扫描电镜
   　　Study of bone marrowderived mesenchymal stem cellscombined with nanohydroxyapatite/collagen in constructing
  s2 J, ^& o7 c4 _0 N
tissueengineering bone in vitro

　　LI Dapeng，SHEN Tiecheng，HUANG Yonghui，ZUO Hua，SHAO Shunxiu7 J; C; Y. n2 y' P) z
5 Z$ _9 k0 q2 G
　　1.School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013;
' R+ Q( O9 J& a' Y  T

  A0 T) X8 W- C
　　2.Department of Orthopaedics， the Affiliated Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212001， China

　　［Abstract］Objective: To explore the feasibility of rabbit marrowderived mesenchymal stem cells(MSCs) and nanohydroxyapatite/collagen(NHAC) in constructing tissueengineering bone. Methods： Rabbit MSCs were isolated and purified in vitro， and the rabbit MSCs of 3rdgeneration were seeded onto prepared NHAC. Their adhesion situation was analyzed by scanning electron microscope(SEM) after 5，10 days.Results： Rabbit primary MSCs and passage MSCs growed adherently with great reproductive activity， and the auxodrome of serial subcultivation MSCs was in accord with Logistic auxodrome. Rabbit MSCs were combined with NHAC to construct tissueengineering bone in vitro， and by the SEM we found that at 10th day the amount（38.52±7.21） of MSCs adhered with NHAC was more than it(21.28±4.70) at 5th day， P/ _/ O4 @1 ?$ m& V1 n2 u. ^  T

　　［Key words］bone marrowderived mesenchymal stem cells;nanohydroxyapatite/collagen;tissueengineering bone;scanning electron microscope5 R8 ^8 b) R; U( f$ H0 u

创伤、炎症、肿瘤等各种原因导致的骨缺损、骨不愈一直是骨科临床上的难题之一。目前常用的治疗方式主要有自体骨移植、异体骨移植和人工骨移植。自体骨移植修复骨缺损效果最好，它能在结构上和功能上完全替代原组织，然而其缺点有供体部位的并发症，感染、畸形以及植骨功能的继发丧失。异体骨移植也存在许多风险，如传播疾病、宿主排斥反应以及来源有限［1］。人工骨移植可避免前二者缺陷，但是缺少骨诱导成分，成骨能力弱。组织工程学是一门以细胞生物学和材料学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科［2］。近年来，骨组织工程的发展为骨科临床医生解决骨缺损治疗难题提供了新的视角。目前，国内外有不少研究证实骨髓间充质干细胞（marrowderived mesenchymal stem cells， MSCs）可以与β磷酸三钙生物陶瓷、小牛脱钙骨等人工骨体外复合进行骨缺损的修复，但是甚少有关于MSCs与纳米晶胶原基骨修复材料（nanohydroxyapatite/collagen，NHAC）体外构建组织工程骨的研究，本实验旨在研究MSCs与NHAC体外构建组织工程骨的可行性，为MSCs复合NHAC修复骨缺损的动物实验奠定基础。6 s5 z: ]* z( o7 z" a0 z
6 |2 l& Q! K" P" j7 Q
　　1材料和方法
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　　1.1动物、试剂和器材

健康雄性新西兰大白兔1只，1月龄，体质量8 R; G9 i9 y+ }; T
) e) \; `$ p) Z$ u
　　1.2方法

　　1.2.1MSCs的分离、培养及传代

　　新西兰大白兔耳缘静脉麻醉（20%乌拉坦，5 ml/ kg）成功后，骶髂部常规备皮、消毒、铺巾，空气栓塞处死（耳缘静脉注射15 ml空气），迅速切开皮肤、皮下组织、腰背筋膜、肌肉，显露双侧髂骨，剪下1.52 cm2骨块，生理盐水冲洗去除表面血细胞，骨剪将骨块剪成细条状，用含15％胎牛血清的LDMEM培养液冲洗细骨条，制成细胞悬液，5105/ml接种培养瓶，37℃，5％CO2，饱和湿度静置培养。3～4 d后首次半量换液，去除不贴壁细胞，以后每2～3 d换液一次。

细胞铺满瓶底后吸尽培养液，PBS漂洗1次，加入0.25%胰酶2 ml，37℃静置2～3 min，倒置显微镜下见细胞间隙增大，细胞收缩时加入含15％胎牛血清的LDMEN培养液终止消化，吸管吹打使细胞悬浮，加入3 ml PBS，1 500 r/min离心5 min，去掉上清液，加入含15％胎牛血清的LDMEM培养液，吹打制成细胞悬液，105/ml接种传代。  ^) g- k! f8 v! O  g8 p. L

　　1.2.2MSCs的生长曲线描绘
* @0 A6 c& f$ p2 g7 I
　　取第3代兔MSCs细胞，0.25%胰蛋白酶消化后加入LDMEM培养液，离心制成细胞悬液，调整浓度至104/ml，每孔1 ml接种24孔板，每天固定时间各取3孔消化，制成细胞悬液，混匀后计数细胞，取3孔平均值，连续8 d，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。

　　1.2.3MSCs成骨诱导后ALP染色

　　取第3代MSCs细胞接种于预制盖玻片的6孔培养板，成骨诱导培养液（含10-8 mol/L地塞米松，10 mmol/L β甘油磷酸钠，50 mg/L维生素C，10％FBS的LDMEM培养液）培养，第6 d取出盖玻片，采用钙钴法（Gomori法）染色。用PBS洗涤盖玻片3次，加1 ml冷丙酮于4℃待冷丙酮挥发，蒸馏水冲洗数次，加入孵育液（2％巴比妥钠5 ml，3％ β甘油磷酸钠5 ml，2％氯化钙10 ml，2％硫酸镁1 ml，蒸馏水10 ml），37℃温箱孵育3 h，用蒸馏水冲洗3次，每次1 min，2％硝酸钴水溶液作用8 min，蒸馏水冲洗3次，每次1 min，2％硫化铵水溶液处理1 min，流水冲洗2 min，再用蒸馏水冲洗1 min，镜下观察细胞。
* J5 L! [& l, ~/ j; m' s: ^7 s
　　1.2.4MSCs与NHAC复合培养

　　将NHAC切割成D=5 mm，L=10 mm大小，使用前LDMEM浸润。24孔板每孔各加100 μl含15％FBS的LDMEM培养液，将NHAC放入24孔板中，将培养的第3代兔MSCs消化后制成细胞悬液，细胞浓度调整到106/ml，吸取100 μl滴到材料NHAC表面，37℃，5％CO2，饱和湿度静置培养2 h后，反转材料，向材料另一面滴加100 μl细胞悬液，37℃，5％CO2，饱和湿度静置培养2 h后，加LDMEM（含15％FBS）浸没材料，37℃，5％CO2，饱和湿度静置培养，每3 d换液1次。9 k" B3 O# {, H6 K9 m0 s* U

　　1.2.5MSCs/NHAC复合物SEM观察  r! ?( `  Q" P, H) d  ~! g9 b; L
1 b: F3 }' A/ J! r% i
　　于复合培养第5,10天分别取出5块MSCs/NHAC复合物，培养液冲洗，2.5%戊二醛固定（0.1 mmol/L的PBS配制，PH7.4），再经1％四氧化锇固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥或乙腈逐级处理，在真空干燥器内用水泵减压抽除乙腈溶剂，表面喷金后用扫描电镜观察，每块复合物在相同放大倍数条件下取5个视野，低倍视野（200）记数细胞，所获数据采用SPSS统计软件进行统计分析。$ P0 _" s, h- v' T  N
$ d7 |, q7 P5 s& w
　　2结果
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2.1MSCs原代、传代培养6 z- l; W, x0 z: V

原代培养的MSCs细胞48 h内大部分贴壁，细胞呈形态较一致的短梭形、多边形，5～7 d时可见明显集落形成，增殖速度快，2周左右细胞互相融合，细胞呈成纤维细胞样，排列呈螺旋状、鱼群状或漩涡状，见图1。传代培养的MSCs贴壁很快（12 h内大多数细胞已贴壁），呈长梭形，见图2，形态更加均匀，生长旺盛，7 d左右即可达到90％融合，10 d左右生长逐渐缓慢。传代培养多数样本第8代以后出现老化征象。/ W6 `( b" C! E! H/ g4 v2 r% J

　　2.2生长曲线描绘2 `6 r1 K1 D" @; b: M- j

第4代兔MSCs生长曲线呈S形，第1～2天为生长迟缓期，第3天进入快速增长期，快速增长期持续到第6天，以后进入平台期，符合Logistic生长曲线，见图3。! J+ y& A7 @+ d2 b6 _4 O! }; B

　　2.3成骨诱导后ALP染色

MSCs成骨诱导培养后6 d，镜下观察细胞形态开始发生明显变化，约40％左右的细胞由长梭形、多边形转变为立方形或多角形。ALP染色，胞浆中出现黑色颗粒或块状沉淀为阳性。! X4 N5 [7 v; \. L: @4 S& U

　　2.4MSCs/NHAC复合物SEM观察
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MSCs与NHAC体外复合培养5，10 d两个观察时间点均发现有细胞呈单层附着生长，主要附着于材料孔隙和表面，细胞伸展，呈梭行或多边形，突起间相互连接呈网状，与NHAC结合紧密，见图4，5。复合培养10 d，粘附于NHAC上的MSCs细胞数量（38.52±7.21）明显高于复合培养5 d时粘附于材料上的MSCs细胞数（21.28±4.70），两组比较差异有统计学意义（P

　　3讨论
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MSCs是一类不同于造血干细胞的具有多向分化潜能的干细胞，能在不同刺激下分化成为骨、软骨、纤维组织、肌肉及脂肪细胞。MSCs在体内的主要分化环境是骨髓以及松质骨的骨小梁内，属于可诱导性骨祖细胞（inducible osteogentic precursor cells，IOPC），其在骨组织受创伤刺激或局部成骨“微环境”的复杂细胞信号传导因素的影响下，能够进行增殖，并最终分化为成骨细胞以参与组织更新和创伤修复。MSCs具有理想的骨组织工程种子细胞应具有的特点：取材容易，对机体的损伤小；体外扩增能力强；易定向分化为成骨细胞；植入体内后能很好地适应受区生理、病理和应力环境并保持成骨活性［3］。它是研究最为广泛，最有应用前景的种子细胞。  S. M5 f/ U* Q3 F: h6 W, y4 H! Q
! P% W; v+ m# d& g2 O$ B* J5 ?$ o
目前MSCs的主要分离方法有四种：①全骨髓法；②密度梯度离心法；③流式细胞仪法；④免疫磁株分离法［4］。全骨髓法和密度梯度离心法因经济、方便而为大多数研究者所采用。全骨髓法（贴壁筛选分离法）操作相对简单，抽取骨髓或取出整块骨块冲洗后直接接种培养瓶。MSCs是贴附生长的细胞，绝大多数细胞一般在24～48 h内贴壁，成梭形或多边形，非贴壁生长的细胞以及之前大量的外周血细胞可以通过换液去除，从而所培养的细胞得以纯化。密度梯度离心法可去除大量的血细胞以及其他骨髓间质细胞，细胞均一性好，便于早期观察和定性细胞研究。腾勇等［5］发现全骨髓法细胞贴壁时间较密度梯度离心法早两三天，可能是全骨髓法保留了骨髓环境中丰富的粘附分子和各种生长因子。故本实验采用全骨髓法来分离培养兔MSCs。. t( q# `0 B6 l: i) x% V* q

MSCs能表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标记，其表面标记没有特异性，对表面抗原Stro1，CD13，CD29，CD44，CD49a，CD49b，CD71，CD90，CD106和D124等均呈阳性反应［6］，对造血干细胞表面标记CD34，CD35和CD45等为阴性反应［7］。由于MSCs没有特征性的形态和特异性的表面标记，目前关于MSCs的鉴定尚无统一的标准，其鉴定一般需要通过细胞形态、表面标记以及诱导后定向分化三者结合进行，其中诱导后定向分化最为重要。从本实验所培养的细胞形态看，细胞呈均一的成纤维细胞形态，呈梭形或多边形贴壁生长，符合MSCs的形态特点；成骨诱导后，细胞形态发生变化，呈立方形或多角形，ALP染色阳性；由于兔单/多克隆抗体很难获得，故本实验没有通过流式细胞仪或免疫组化进行细胞表面标记的检测；但是通过细胞形态以及成骨诱导后ALP染色可以证明本实验所培养的细胞是兔MSCs。# p  _4 D2 @3 l4 U

清华大学廖素三等［8］研制的纳米晶羟基磷灰石胶原基骨修复材料与天然骨成分接近，结构和形貌图谱分析与天然骨相似，有利于细胞的粘附、生长及分泌胶原，促进钙化；具有片层结构和纳米晶的特点，有很好的生物相容性［9，10］；其表面的纳米级晶体有利于细胞的吞噬降解，有实验反映纳米人工骨的降解率4周达19.6％［11］，这样达到材料降解与新骨形成的速率相匹配；SEM结果表明：材料多孔，孔径较大、孔隙率及孔隙交通率高，有利于细胞增殖。NHAC符合作为骨组织工程支架材料的主要性能，已被批准在国内临床上使用。沈铁城、黄永辉等［12，13］将NHAC应用于临床，证实其效果接近自体骨移植，达到自体骨移植的金标准，是一种理想的骨修复材料。本实验将MSCs接种于NHAC，5 d后SEM见少量细胞与支架材料复合；10 d后SEM发现NHAC表面及孔隙有大量的MSCs复合，细胞相互连接成网，结合紧密，说明我们所构建的MSCs/NHAC复合物可以作为一种理想的组织工程骨，但是需要10 d左右的复合培养时间。本研究以兔MSCs作为骨组织工程种子细胞，NHAC作为支架材料体外构建的组织工程骨，既保持了NHAC所具有的优点（良好的生物相容性；适当的生物降解性；三维立体多孔结构；利于细胞粘附、增殖，激活细胞特异基因表达等），又结合了大量的MSCs，使得成骨性能大为提高，提示是一种理想的组织工程骨，为进一步动物实验奠定了良好的基础。但是我们所构建的组织工程骨应用于大段骨缺损修复的效果，以及能否应用于临床，需要下一步动物实验来证实。+ `5 y3 N, R0 S: d- L
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［基金项目］江苏大学科技发展基金资助项目（JLY20050008）

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