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作者：张蕾蕾 许文荣 乔纯 钱晖 朱伟 李继刚 周洪兴 司煜安 周宗海 阴晴作者单位：江苏大学1.医学技术学院； 2.附属医院检验科，江苏 镇江 212003 & F+ F! ~1 d+ U9 ?- |* m
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【摘要】 目的： 克隆人骨髓间质干细胞ING4（inhibitor of growth famility,member4）基因，构建其慢病毒表达载体PNLING4。方法： 提取人骨髓间质干细胞（hMSCs）总RNA，经RTPCR扩增出ING4cDNA，克隆至PMD19T载体，选择阳性克隆进行酶切鉴定和测序，构建慢病毒表达载体PNLING4，用双酶切、基因测序进行鉴定。结果： RTPCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确。结论： 成功从hMSCs克隆了ING4基因并成功构建其慢病毒表达载体PNLING4，为进一步研究ING4基因的作用与抗肿瘤机制奠定了基础。 , e6 P* k' V% \! d; U/ A [
【关键词】ING4 慢病毒表达载体 人骨髓间质干细胞 克隆
- w* G4 Y- u" O6 b+ x Cloning of human ING4 drived from MSC and construction of PNLING4 Lentiviral vector, Y$ U) o2 N9 O! r" f
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ZHANG Leilei， XU Wenrong， QIAO Chun， QIAN Hui， ZHU Wei，LI Jigang， ZHOU Hongxing， SI Yuan， ZHOU Zonghai， YIN Qin
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1.School of Medical Technology;9 F& \+ n" I8 Z8 y
; m2 I- a# k, u' n8 f 2.Deparment of Clinical Laboratories, the Affiliated Hospitial , Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212003，China* V4 G4 m6 J v' ?' @' K0 D
' r/ N& ^' i" n; l: M ［Abstract］Objective: To clone the gene of human ING4 derived from human bone marrowderived mesenchymal stem cells(hMSC) and construct PNLING4 lentiviral vector.Methods： The cDNA of ING4 was amplified by RTPCR using the total RNA extracted from hMSC. The PCR product was inserted into PMD19T vector. The positive recombinant clone was analyzed by digestion of restriction endonuclease and DNA sequencing. The correct sequence was subcloned into Lentiviral vector. The identification was performed by analysis of restricting enzyme digestion and DNA sequence. Results： RTPCR product was a 750bp specific fragment. Restriction enzyme digestion and DNA sequencing revealed that ING4 cloning was successful.Conclusion： The gene encoding human ING4 derived from MSC and PNLING4 lentiviral vector were obtained, which laid a basis for further researching on its function and tumor suppress mechanisms.& i- ~, }% i, [7 Z
5 ]6 ?: P4 _6 T9 j, `/ f! x2 B- S ［Key words］ING4;lentiviral vector;hMSC;clone: l2 l5 k; O0 l! I R' `* o4 r
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在肿瘤的发生和发展过程中涉及两大类基因，即原癌基因和抑癌基因，其中抑癌基因可能是抵御肿瘤发生的重要因素。肿瘤生长抑制因子家族是肿瘤抑制基因p53活动所必须的一个蛋白家族，1996年Garkavtsev等［1］首先报道了ING1基因，以后又陆续发现了ING2、ING3、ING4及ING5。ING4（inhibitor of growth famility,member4）是近年来发现并被认为是一种较强的候选抑癌基因, 以p53依赖的方式抑制细胞生长,促使细胞凋亡。为了进一步研究ING4的生物学功能和探索抗肿瘤治疗新途径，我们克隆了人骨髓间质干细胞来源的ING4基因并成功构建其慢病毒表达载体PNLING4。& G/ F- L! z# O: Z" |4 G
2 r. X% x; d8 p, b 1材料和方法# k L, \0 T" Z
8 U$ _$ F" Z6 }, V 1.1细胞、菌种和质粒
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) } _$ \( G" J9 O: E2 ^# b人MSC细胞、E.coli DH5α菌株和PNLires慢病毒表达载体由本室保存，PMD19T载体为TaKaRa公司出品。
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1.2酶、主要试剂和仪器6 ~& _- C" u3 m
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Trizol为invitrogen公司产品。RTPCR试剂盒为TOYOBO公司产品。Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCL2均为TaKaRa公司产品。限制性内切酶EcoR I、Nhe I为New ENGLAND BioLabs公司产品。PCR纯化试剂盒、质粒小提试剂盒为Axygen公司产品。DL2000 DNA 标准参照物为TaKaRa公司产品。T4连接酶购自Fermentas公司。凝胶成像系统为Gene GENIUS出品，PCR仪为Eppendorf公司产品。
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% u$ A: I: j) k/ d 1.3引物设计
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* Y0 k$ S3 M' N2 g' f参考基因库登录的人ING4基因序列（BC007781/http://www.ncbi.nlm.nih.gov）进行设计，由上海生物工程技术服务有限公司合成，在上游引物中加入Nhe I酶切位点，下游引物中加入EcoR I酶切位点，序列如下：上游引物P1：5′GGGCTAGCATGGCTGCGGGGATGTATTTG3′下游引物P2：5′CCCTTAAGGATAAAGAAGAAGGCAAGAAC3′。
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1.4RTPCR扩增人ING4 cDNA" R3 G y7 `( J: V5 H& y
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(1)取人MSC细胞约3105,按RNA抽提程序进行总RNA的提取。(2)取3 μl总RNA，15 mmol/LOligodT加入1μl，5RT缓冲液4 μl，10 mmol/LdNTPs 2 μl和1 μlRNA酶抑制剂，Rever Tra Ace1μl，最后加双蒸水至总体积20 μl，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min后，可获得cDNA模板。(3)取1 μl cDNA作为模板用上述特异引物进行PCR扩增，扩增体积为25 μl，首先94 ℃ 5 min预变性，然后进行下列循环，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，72 ℃下延伸10 min。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Gene GENIUS凝胶成像系统分析鉴定。
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1 W# K' D; V0 L$ I1 L/ E, ? 1.5慢病毒表达载体的构建与鉴定
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2 t M( f! T% Y) ~将人ING4 cDNA与PMD19T载体进行体外连接（参照TaKaRa公司PMD19T载体系统说明书进行），然后转化E.coli DH5α感受态细菌，用氨苄抗性和蓝白斑筛选法挑选阳性菌落并进行测序，取测序正确的重组质粒进行大量扩增。用EcoR I、Nhe I自PMD19T载体上切下目的基因定向连接至PNLires慢病毒表达载体对应酶切位点上，构建成人ING4基因慢病毒表达载体PNLING4，转化感受态菌E.coli DH5α，挑选阳性菌落进行测序。阳性克隆中的慢病毒表达载体鉴定采用双酶切法（EcoR I、Nhe I）和测序。
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Q* E4 ]# y B# u9 y# [( c 2结果( I8 P, l) ^) u9 i: V: g
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2.1人ING4 cDNA的克隆1 _: Q) Q3 z7 R# t- ~
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经RTPCR扩增得到的产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测，可见750 bp大小的DNA片断，与理论预测结果相符（图1）
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2.2TA克隆重组质粒的筛选与鉴定
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将纯化的PCR产物与PMD19T载体连接，产物转化DH5α菌，蓝白斑初筛。随机挑取白色菌落，抽提质粒，双酶切鉴定出现750 bp大小的条带（图2）。- Z. V0 B% a& o& C4 M8 j/ M
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2.3基因测序与分析 h9 L$ Z- p3 s3 M' X: n: D! N, \- ?
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测序结果与已发表的序列(BC007781/http://www.ncbi.nlm.nih.gov)完全一致。
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2.4慢病毒表达载体PNLING4的鉴定! K0 F0 w# @- R% B, N1 k
" s! Y# Z/ x2 e# ?PNLING4双酶切（EcoR I、Nhe I）出现750 bp大小的条带（图3），测序结果同上，表明重组载体构建正确。
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3讨论
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0 `$ g/ R0 w- B0 L+ I+ r) U- {2 HING基因可见于人、小鼠、酵母菌、蛙中，其家族成员有ING1、ING2（ING1L）、ING3、ING4、ING5，它们彼此之间保持较高的同源性，相似率为32%～76%［2］。ING4基因定位于人染色体12p13-31,由8个外显子和7个内含子组成［3］。其编码蛋白的羧基端区域存在PHD（plant homeodomain）指状结构（C4HC3型锌指结构），PHD结构作为大分子的识别域，既可与DNA和RNA结合，发挥转录调节功能，同时对染色体的再塑形也起调节作用。ING4的氨基端则主要与蛋白质的相互作用有关。ING4基因与细胞的生长、衰老、锚定依赖性生长和凋亡以及维持基因结构的稳定、调节细胞周期、增强细胞对化疗药物的敏感性有关。其对细胞的生长抑制作用是通过提高p53依赖的p21/waf1启动子活性而发挥作用。4 Y: L2 |8 R8 L) f0 M
6 x1 }* [# m% ~4 N# J! _5 {目前在基因库中关于ING4 mRNA有两种不同的序列报道［NM_016162（1717bp编码248个氨基酸），BC007781（1377bp编码249个氨基酸）］。两者的区别在于一条氨基酸序列在131位上是S，而另外一条在131-132位则是KG，但这些变化并不影响ING4的阅读框架［4］。本实验测序结果与已发表的序列(BC007781/http://www.ncbi.nlm.nih.gov)完全一致。有报道称，在ING4中部区域存在一个潜在的二连核定位信号域（NLS），在ING4与p53的结合中起着重要作用，当NLS区域发生特定突变或完全缺失时，ING4与p53不论在体内实验还是体外实验中都不发生相互作用。NLS区域的突变可以使ING4在核内的定位发生改变，干扰ING4与p53的相互作用，甚至影响p53依赖的p21/waf1启动子活性［4］。
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3 y$ R: `0 W5 ]! z) b: o( Y在不同肿瘤细胞中ING4基因突变的发现近来也有不少报道，以379-390的缺失较多见［5］，另有报道称，这些高频缺失常发生在12p31和12q37［6］。在本实验过程中，我们也发现了一个有趣的现象，随着骨髓间质干细胞传代数目的增多，点突变、错配和缺失的频率也越来越高，大多也发生在上述区域内。这一发现为间质干细胞突变为肿瘤细胞增加了一种新可能，其机制有待于进一步研究。
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慢病毒表达载体以其可感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片断大、整合至靶细胞基因组表达时间长、免疫反应小等优点应用越来越广。本实验选用慢病毒表达载体构建PNLING4的目的在于利用其适用于体内基因治疗的特点，进一步研究ING4基因对肿瘤细胞周期及凋亡的影响，为探索抗肿瘤治疗的新途径奠定基础。
" b# c9 M( Q5 s, t: i4 g0 r& ~ 【参考文献】
* r, p5 R/ O* |/ v5 P' c ［1］Garkavtsev I, Kazarov A, Gudkov A, et al. Suppression of the novel growth inhibitor p33ING1 promotes neoplastic transformation［J］.Nat Genet, 1996, 14(4):415-420.8 N, V0 ^ {- }$ z* r; n, P
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［2］赵 帅, 贺修胜.ING1基因与肿瘤的研究新进展［J］.医学综述,2005,11(5):444-446.
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［3］Igorl G, Sergey K, Olga C, et al. The canditae tumour suppressor protein ING4 regulates brain tumour growth and angiogenesis［J］. Nature, 2004,428(6980):328-332.
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$ Q& @6 b& @. e+ Z: [. m& j, Q
0 l* T6 Y5 \9 n1 l ［4］Zhang X, Wang KS, Wang ZQ, et al. Nulear localization signal of ING4 plays a key role in its binging to p53［J］.Biochem Biophysical Res Com, 2005,331(4):1032-1038.
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/ A8 j6 T* Q" N- e- t5 F
: i! n. o U8 X' B) B ［5］Kim SW, Chin K, Gray JW, et al. A screen for genes that suppress loss of contact inhibition: Identification of ING4 as a candidate tumor suppressor gene in human cancer［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(46):16251-16256. j$ x* ?* d1 r1 c2 @" [" D
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& K0 c8 D/ f( i ［6］Gunduz M, Nagatsuka H, Demircan K,et al. Frequent deletion and downregulation of ING4, a candidate tumor suppressor gene at 12p13,in head and neck squamous cell carcinomas［J］.Gene,2005,356:109-117.1 d! d) @- {% k) j2 n m7 N$ U
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, M7 X( x% ^# z［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（30471938）； 卫生部科研课题基金资助项目（WKJ2005-2-024）； 镇江市检验医学重点实验室资助项目（2006066）； 镇江市社会发展基金资助项目（SH2005064）； 江苏省医学领军人才资助项目 |
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发表于 2009-3-3 12:34
发表于 2015-5-22 13:34
