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作者：张为西作者单位：中山大学附属第一医院神经科，广东 广州 ５１００８０ j5 x$ M0 v% q8 y' r
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4 E7 W& e* r3 I5 e1 F 【摘要】 建立小鼠骨髓间质干细胞（ＭＳＣ）体外培养、纯化、扩增方法，并进行体外定向诱导条件下的多向分化潜能鉴定。【方法】 取３～１８月雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠（共４８只）骨髓细胞，贴壁培养后，用免疫磁珠法纯化，观察纯化后的细胞形态，对３、１０、２０代的ＭＳＣ进行细胞生长曲线绘制；并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞的分化能力。【结果】 小鼠ＭＳＣ在体外可以诱导成成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞。ＭＳＣ连续传代培养达３０代以上，细胞的形态、抗原表达无改变，并保持多向分化潜能。【结论】 该方法获得的ＭＳＣ具有高度增殖、多向分化潜能、生物学特性稳定的特点。
! G2 J$ n* n% A+ {, k6 a 【关键词】小鼠 髓间质干细胞 体外培养 多向分化潜能8 \7 d; V; v9 w+ H4 ^# }9 N
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ
) E# V, P' y5 {3 u2 [7 Q' \! m! g9 h3 E, C* w6 o+ `
ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉ-ｘｉ， ＣＨＥＮ Ｓｏｎｇ-ｌｉｎ， ＹＡＯ Ｘｉａｏ-ｌｉ， ＬＵ Ｘｉ-ｌｉｎ， ＺＨＯＵ Ｃｈｅｎ１， Ｘｉｎｇｍｉｎｇ ＳＨＩ
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0 j- K$ P f9 K* g １． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０， Ｃｈｉｎａ；２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ，Ｇｅｏｒｇｉａ ３０９１２，ＧＡ， ＵＳＡ
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, X: G1 i5 F7 w( { Ａｂｓｔｒａｃｔｓ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ， ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ３～１８ ｍｏｎｔｈｓ ｏｌｄ ｍａｌｅ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｉｃｅ （４８ ｍｉｃｅ）， ａｎｄ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ， ｅｎｒｉｃｈｅｄ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＭＳＣｓ ｆｒｏｍ ｐａｓｓａｇｅｓ ３， ｐａｓｓａｇｅｓ １０， ａｎｄ ｐａｓｓａｇｅｓ ２０ ｗｅｒｅ ｐｒｏｔｒａｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅｉｒ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ， ａｄｉｐｏｃｙｔｅ， ａｎｄ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｃｏｕｌｄｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｍｕｒｉｎｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｔｈｅ ＭＳＣ ｒｅｔａｉｎｅｄ ｔｈｅｉｒ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ３０ ｐａｓｓａｇｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｆｒｏｍ ｆｒｏｚｅｎ ｓｔｏｃｋｓ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｔｈｅ ＭＳＣ ｃａｎ ｂｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ， ｅｘｐａｎｄｅｄ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｏｕｒ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｈａｖｅ ｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．
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- G3 d. ?) q2 `3 p g! b Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｏｕｓｅ； ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ； ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
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骨髓间质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣ）是来源于中胚层的成体干细胞，具有高度增殖和多向分化的潜能，是一种理想的组织工程种子细胞，广泛地运用于基因治疗和组织工程领域。由于小鼠基因与人类基因有９０％的同源性，故获得高质量的小鼠ＭＳＣ是研究许多疾病的基础。然而，小鼠的ＭＳＣ的分离、纯化和扩增较大鼠和人的ＭＳＣ更加困难，而且所获得的ＭＳＣ往往混杂有造血干细胞，不仅其形态不甚一致，而且也不具备多向分化的潜能［１，２］。所以本实验采用常规的细胞贴壁培养和使用多种抗体进行免疫磁珠纯化相结合的培养方法，不仅是小鼠ＭＳＣ体外培养、纯化、扩增的一个简单、稳定的方法，而且在体外定向诱导条件下具有多向分化潜能。9 y: C4 F: t* [; \- u- q
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１ 材料和方法( s! T; g+ L1 R! i7 N$ d& D5 v
% ~, A1 S, A/ d: P: z* k0 Y$ J １．１动物和试剂
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３ ～ １８月雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ 小鼠，每次实验使用６只，体质量１８ ～ ２６ ｇ，购于美国Ｊａｃｋｓｏｎ实验室。每只笼饲养３～５只，室温，１２ ｈ日光，１２ ｈ夜间循环， 标准啮齿类动物饮食，动物的处理和饲养均遵循美国ＮＩＨ指南。除了特别标识外，所有化学试剂均购于美国 Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ公司。$ q+ f! [7 \ a( e
5 m9 G0 o4 ^ @" W １．２小鼠骨髓间质干细胞的体外分离和扩增# R9 _" U: S$ A: ?( T! c
- {. p0 n6 \! S2 @6 m: m/ f 用ＣＯ２窒息实验小鼠后，取四肢股骨、胫骨于无菌培养皿中，去除肌肉和所有结缔组织，ＰＢＳ冲洗３次后，用剪刀剪断骨的两端，用２１号注射器从一端骨骺开口处，推入无血清ＲＰＭＩ-１６４０溶液，冲出骨髓，置于另一无菌培养皿中，用注射器来回吸吹，至骨髓分散成单细胞悬液为止，再用无血清ＲＰＭＩ-１６４０溶液悬浮离心２次（１ ０００ ｒ／ｍｉｎ， 离心半径１５ ｃｍ，５ ｍｉｎ），去上清，加入ＣＩＭ培养液（ＣＩＭ培养液包括ＲＰＭＩ-１６４０，加９ ｍＬ／Ｌ胎牛血清，９ ｍＬ／Ｌ马血清，１００ Ｕ／ｍＬ青霉素，１００ μｇ／ｍＬ链霉素，１２ μｍｏｌ／Ｌｌ-谷胺酰胺），吹悬后，约每只小鼠的骨髓细胞接种于直径１００ ｍｍ培养皿中，体积分数５％ ＣＯ２、３７ ℃饱和湿度的二氧化碳培养箱内静置培养，３ ～ ２４ ｈ后，用ＰＢＳ冲去悬浮细胞，加新鲜培养液，对于该贴壁细胞（０代细胞），每周换液２次，至４周。
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2 E) F |. j# R: S5 f3 l) o １．３小鼠骨髓间质干细胞的纯化0 } \4 C7 v, i1 _+ B- X
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细胞培养４周后，在细胞融合达７０％ ～ ８０％ 时，ＰＢＳ冲洗１次，用２ ｍＬ２．５ ｇ／Ｌ 胰蛋白酶消化２ ｍｉｎ，ＰＢＳ缓冲液重悬后，加入共轭抗小鼠 ＣＤ１１ｂ， ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０ ａｎｄ Ｐａｎ ＤＣ 的磁性颗粒， １２℃孵育３０ ｍｉｎ，再放入磁性分选装置ＩＭａｇｎｅｔ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中８ ｍｉｎ。将细胞分选成ＣＤ１１ｃ＋， ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０＋， 和ｍＰＤＣＡ＋，然后收集ＣＤ１１ｃ－， ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０－和ｍＰＤＣＡ－细胞，再用抗Ｓｃａ-１ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ 结合该细胞，放入磁性分选装置ＩＭａｇｎｅｔ中８ ｍｉｎ，最后收集Ｓｃａ-１ 阳性细胞。最后，将这些纯化后ＣＤ１１ｃ－，ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０－和ｍＰＤＣＡ－，Ｓｃａ-１＋的贴壁细胞放入ＣＩＭ培养基扩增，细胞密度约１ ０００ 细胞／ｃｍ２，每周换液２ ～ ３次。; o# |2 [' [. `# n' l0 |
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１．４纯化后ＭＳＣ抗原性检测
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( x1 N+ o5 I2 O1 {% D; H3 L １．４．１细胞免疫荧光检测
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将上述细胞用ＣＤ１１ｂ， ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＣＤ４５）单克隆抗体进行免疫荧光检测：ＣＤ１１ｂ， ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０阳性细胞多为混杂细胞，而ＣＤ１１ｂ， ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０阴性细胞形态更加单一，近似于成纤维细胞。在细胞约５０％融合时，对ＣＤ１１ｂ＋，ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０＋， ｍＰＤＣＡ＋和ＣＤ１１ｂ－， ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０－， ｍＰＤＣＡ－细胞分别用ＰＢＳ冲洗２次，４０ ｇ／Ｌ多聚甲醛在室温固定 ２０ ｍｉｎ，ＰＢＳ 冲洗３次后，１０ｇ／Ｌ ＢＳＡ室温阻断１ ｈ，加入１∶６００的ＦＩＴＣ共轭大鼠抗小鼠ＣＤ１１ｂ， ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０单克隆抗体，室温避光孵育１ ｈ， ＰＢＳ冲洗３次后，用３００ ｎｍ ＤＡＰＩ染细胞核３ ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗３次后封片，荧光显微镜下照相。4 \2 I$ I2 d- _, a# @4 x/ i" J
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１．４．２流式细胞仪检测
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分别取纯化后的ＣＤ１１ｂ阴性细胞、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０阴性细胞、Ｓｃａ-１阳性细胞（１１０６／ｍＬ），重悬于ＤＭＥＭ培养液中，加入ＦＩＴＣ标记的抗小鼠ＣＤ１１ｂ，ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０以及Ｓｃａ-１，４℃孵育３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤后用流式细胞仪分析结果，同型抗体检测为阴性对照。
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) Q: Y9 z0 M% r, L １．５ＭＳＣ生长曲线绘制
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分别取Ｐ３、Ｐ１０、Ｐ２０代ＭＳＣ以１１０４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２ 的密度接种于４８孔培养板内，于培养１～１０ ｄ定时消化３个复孔细胞，计数，绘制细胞生长曲线。* h% z, p. J9 F8 S4 g6 O+ N
, v7 D; ?: I5 k １．６成骨细胞分化
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１ １０４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２ 的ＭＳＣ 细胞种植在９６孔版上培养，当细胞接近融合时，加入成骨细胞诱导培养液诱导（ＤＭＥＭ，２％胎牛血清， ５ ｍｍｏｌ／Ｌ β-甘油磷酸， ５０ μｍｏｌ／Ｌ 抗坏血酸），隔日换液，对照组则用ＤＭＥＭ培养基常规培养。持续诱导１周后，进行ＡＬＰ染色和ＡＬＰ活性测定。３周后对于钙沉积用ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ 和Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｏ 染色鉴定。, b; O" f7 U% V; T; l
( K2 d% e$ f9 g( m/ I& a6 | １．６．１碱性磷酸酶染色/ T# ?3 p6 @( F! {5 g) l
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用无磷酸钙的ＰＢＳ冲洗细胞３次后，４０ ｇ／Ｌ多聚甲醛室温固定 ３０ ｍｉｎ，双蒸水冲洗３次后，用 Ｏｎｅ-ＳｔｅｐＴＭ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ 溶液（ＰＩＥＲＣＥ）染色１５ ｍｉｎ，双蒸水冲洗３次后，扫描仪扫描纪录其颜色的改变。& S5 y( d, X+ Z$ B. M! S- k
B' W+ y/ U1 R9 h2 W １．６．２碱性磷酸酶活性测定（ＡＬＰ ａｃｔｉｖｉｔｙ）
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细胞用 ＰＢＳ 冲洗后，在０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００反复冻融３次，细胞裂解物孵育在３７ ℃磷酸盐底物３０ ｍｉｎ，加入５ μＬ １ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ终止反应，测定４０５ ｎｍ波长的光密度。同时用蛋白浓度作标准化处理。ＡＬＰ 活性用Ｓｉｇｍａ单位表示，１个Ｓｉｇｍａ单位等于每小时释放１ ｍｏｌ ｐ-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ的酶活性。
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& w! ]" H. j* v1 w) x) g １．６．３Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色
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用无钙镁离子的ＰＢＳ冲洗细胞后，４０ ｇ／Ｌ多聚甲醛室温固定 ３０ ｍｉｎ， 用 ５０ ｇ／Ｌ 硝酸银溶液（Ｆｌｕｋａ）在暗室中染色 ３０ ｍｉｎ，用水轻轻冲洗后，在紫外光下照射３０ ｍｉｎ，扫描记录其颜色改变，对于细胞钙的沉积，Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色成黑色，没有钙的沉积则不显色。 |' p7 a2 _3 b3 p* O( @- n0 k* e
! r1 d2 N2 w) F3 t; z8 M6 q1 ?1 i １．６．４Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ 染色（ＡＲＳ）
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用无磷酸钙的ＰＢＳ冲洗细胞３次后， 用７０％冰冻乙醇固定细胞１ ｈ， 用水冲洗后， 用 ４０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＲＳ 溶液（ｐＨ ４．２） 室温下染色１０ ｍｉｎ， 用水冲洗５次后，再用 ＰＢＳ洗１５ ｍｉｎ以洗脱非特异性染色， 染成红色的细胞为脂肪细胞，用扫描仪扫描纪录。定量分析时，用１０ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．０磷酸盐配制的１００ ｇ／Ｌ ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ （ＣＰＣ）在室温孵育１５ ｍｉｎ，溶解下来的染料通过测定 ５７０ ｎｍ的光密度值来定量。
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- _+ M1 C8 L3 E4 p １．７脂肪细胞分化和Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ 染色
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将３０ ０００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２的ＭＳＣ细胞种植在２４孔培养板上，在细胞融合后２ ｄ，加入脂肪细胞诱导培养液 （ＤＭＥＭ 加１０ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ， １ μｍｏｌ／Ｌ 地塞米松， ２００ μｍｏｌ／Ｌ 消炎痛，１０ μｇ／ｍＬ 胰岛素， ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｂｕｔｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ） 诱导３ ｄ后，改用维持培养液 （高糖ＤＭＥＭ ， １０ ｍＬ／Ｌ加 １０ μｇ／ｍＬ 胰岛素）。 隔日换液１次，直到出现典型的脂肪细胞。在进行照相纪录后，用 ＰＢＳ 冲洗后，４０ ｇ／Ｌ多聚甲醛室温固定 ６０ ｍｉｎ，再用ＰＢＳ 冲洗３次，用新鲜配制的５ ｇ／ＬＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ 工作液（异丙醇和双蒸水的比例为６∶４）室温中染色１ ｈ，双蒸水冲洗２ ～ ３次后，脂肪细胞呈现红色，其它细胞不着色，此时尽快拍照。然后，去除所有水分，用异丙醇溶解该染料，可测ＯＤ５００进行定量比较。) u, b$ V4 E# E5 z0 v
6 @$ s0 j- \0 R2 ]# Q1 p １．８肌肉细胞分化1 P$ [* a4 Z/ ?4 e2 B/ L% X
' f( O- j! L. z9 h+ o9 ^9 M) Y. F, { 将约５ ０００个ＭＳＣ细胞接种在６孔培养板上，当细胞密度约４０％ ～ ５０％ 融合后，用含１０ μｍｏｌ／Ｌ ５-氮胞苷的ＤＭＥＭ培养液中诱导２４ ｈ，ＰＢＳ冲洗２遍后，换成不含５-氮胞苷的常规培养基，隔日换液，直到出现典型的多核细胞和肌管样结构进行照相。5 ]# s" F9 {& g, s
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２ 结 果
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; t8 i7 {# |8 s ２．１ＭＳＣ 的培养和纯化0 P9 z& l, E% \2 ^) h
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纯化前的贴壁细胞为混合细胞，形态大小不一。但经免疫磁珠法纯化后的细胞，形态较为一致，继续低密度培养至２个月时，呈爆发式生长。细胞传代到第３代时，细胞形态基本一致，类似于成纤维细胞。这些细胞基本没有单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、髓样来源的树突样细胞、自然杀伤性细胞、Ｂ-１细胞、Ｂ淋巴细胞、Ｔ淋巴细胞、典型的ＤＣ 细胞、血浆细胞样的ＤＣ细胞、巨噬细胞前体细胞（图１）。随着不断传代，其形态更加一致。# }7 w. r' c; z, w' ^+ N
- [) b/ @* c7 H ２．２纯化后ＭＳＣ抗原性检测+ u7 |) f4 K2 ]) u
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用ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｓｃａ-１单克隆抗体进行免疫荧光检测发现：纯化后的ＭＳＣ 呈ＣＤ１１ｂ、 ＣＤ４５阴性，Ｓｃａ-１阳性。流式细胞仪检测显示：纯化后的ＭＳＣ呈ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５阴性，Ｓｃａ-１阳性细胞比例达９５％以上。各代间无明显差异，表明ＭＳＣ细胞表面标志具有稳定性。
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２．３ＭＳＣ增殖特点1 ^7 ]8 i _( f
( a! `5 d n- y# ~1 ~, P 以１１０４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２ 细胞种植培养，第１～２天细胞生长缓慢，第３天开始进入对数生长期，在细胞融合至７０％～８０％时传代，避免融合后分化潜能的减低。细胞反复冻融以及传代３０代以上，细胞的形态没有改变，生长良好。不同代的ＭＳＣ 生长状况基本一致（图２）。! R" x4 d' X/ S, l8 U; S5 N# f: m
# a. G- u" {* g ?5 B ２．４ＭＳＣ 体外多向分化潜能+ r7 F+ E& f( w3 J0 p8 S* H
6 q+ p! M; F' Y/ [$ J" G: _) U4 H/ G- `
/ q* G; l; C* A) o% m9 }: i 在一定的体外诱导条件下，ＭＳＣ可以向成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞三个方向定向分化，具有多向分化潜能。$ U7 d4 _ |- k6 A6 m
* H, }0 ?" ^8 O) }- d1 w8 @ ２．４．１ＭＳＣ诱导成成骨细胞3 f& n- T, B9 R2 H$ r
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成骨细胞诱导培养液（ＯＳ）诱导１周后，进行ＡＬＰ染色发现：ＯＳ诱导的细胞染色呈紫蓝色，对照组不明显（图３Ａ）。ＡＬＰ活性测定显示：ＯＳ诱导的ＭＳＣ细胞ＡＬＰ活性为０．６５ ± ０．１４， 对照组为０．２７ ± ０．１４， 两者相比有显著性差异（Ｐ＝０．０３）。ＯＳ诱导３周后，对于细胞钙的沉积，Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色成黑褐色，而对照组没有钙的沉积则不显色（图３Ｂ）。进行ＡＲＳ染色细胞钙的沉积为橘红色（图３Ｃ），定量分析发现：ＯＳ组的ＯＤ５７０值为：１．０４ ± ０．００７７， 对照组为０．０５ ± ０．０００４， 两者相比有显著性差异（Ｐ ＝ ０．００７）。' A6 E; ]3 x4 h; T0 V1 R
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２．４．２ＭＳＣ 诱导成脂肪细胞 r, n$ Y, ?" Z
$ e( v' h @! H- p$ I1 C ＭＳＣ在脂肪细胞诱导培养液中诱导培养后，出现典型的脂肪滴，随着诱导时间的延长，细胞体积逐渐增大，而对照组不出现脂肪细胞（图４Ａ）。油红染色呈红色脂肪空泡（图４Ｂ）。6 r) B) W: j. g! y C$ k/ i. q
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２．４．３ＭＳＣ 诱导成肌肉细胞
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ＭＳＣ在肌肉细胞诱导培养液中诱导培养７ ｄ后，出现长梭形样细胞，平行排列，随着培养时间延长，细胞体积逐渐增大，出现长管形的肌管，细胞核明显增多，多位于细胞中央（图４Ｃ）。
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8 E; N9 m+ O$ j" C E ３ 讨 论& x+ Y. A0 @( K- q/ w4 R8 @
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由于小鼠和人类基因的同源性高，小鼠ＭＳＣ被广泛应用于组织工程、细胞治疗、基因治疗等多个领域。然而小鼠ＭＳＣ的获得相对于大鼠和人的ＭＳＣ更加困难，不仅培养周期长（多在２月以上），容易污染，而且所获取的细胞不一定有很好的多向分化潜能［２-４］。这是由于不仅ＭＳＣ在小鼠骨髓中含量少（约２ ～ ５个／１０６骨髓单核细胞），而且和其它多种细胞混杂在一起，同时ＭＳＣ无特异性免疫表型，纯化比较困难。目前，小鼠ＭＳＣ的培养尚无统一的标准，特别进行纯化时使用的抗体也是多种多样，并有一定争议［５-９］，部分学者采用贴壁培养的方法获得此细胞，往往培养周期更长，获得的细胞形态不均一，特别是混有造血干细胞，而且细胞的多向分化潜能也不理想。对于ＭＳＣ细胞扩增困难，有认为在培养时加入细胞因子ＥＧＦ和ＰＤＧＦ，虽然可以有利于细胞的扩增，但是有人认为影响细胞的多向分化潜能。1 L6 k) V0 q" K5 ?7 `- K
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为此我们结合了Ｔｒｏｐｅｌ［２］、Ｐｒｏｃｋｏｐ［４］和Ｇｕｏ等［１０］的ＭＳＣ培养方法，先进行骨髓细胞的贴壁培养约４周，用ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０和Ｓｃａ-１抗体纯化。先用抗体ＣＤ１１ｂ、 ＣＤ４５对细胞进行纯化，去除ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５阳性细胞，从而去除了大量的造血干细胞，再用Ｓｃａ-１抗体纯化，选择Ｓｃａ-１阳性细胞，保证其干细胞的特征。一般纯化前的细胞数量要多，纯化后的骨髓细胞最好低密度培养，因为此时细胞生长静止期约２月，随后便出现ＭＳＣ克隆，传代后便可以大量扩增。在培养时，还需要注意血清的质量，因为高质量的血清也是得到高质量ＭＳＣ的一个重要因素［６］。对于该细胞在体外一定的诱导条件下，诱导出具有骨细胞的特点，不仅ＡＬＰ明显升高，细胞基质有钙沉积，Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色和Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ 染色呈阳性染色。同时也可诱导出脂肪细胞，油红Ｏ染色阳性，在５-氮胞苷诱导下，诱导出典型的肌管。即同一种细胞可以诱导出三种不同类型的细胞，即多向分化的潜能。多次实验发现小鼠骨髓细胞更容易诱导成成骨细胞。在得到ＭＳＣ后，我们进行反复传代３０代以上以及反复冻融时，细胞容易成活，其形态、抗原特征、增殖能力以及分化功能都没有明显改变，具有一定的稳定性。& |& T7 A" q$ c+ R
1 c. b9 V* ?" ]( q" ^ 因此，采用本方法培养、纯化、扩增的ＭＳＣ具有骨髓间质干细胞的特点，不仅能够贴壁培养，形态类似成纤维细胞，对造血干细胞具有支持作用，具有干细胞的表型特征，能够自我更新，反复传代培养而保持细胞的形态和功能，而且在一定的诱导条件下，具有三向分化的潜能，为研究相关疾病或组织工程的基础研究和治疗策略提供了重要的手段。4 ~0 r5 k* a* P# ~% Y
( z, ?$ }5 @6 J0 i0 s
9 C* e$ u6 f# w 【参考文献】
+ @: p ^) P* z Ｓｅｋｉｙａ Ｉ， Ｌａｒｓｏｎ Ｂ Ｌ， Ｓｍｉｔｈ Ｊ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａ： Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｍａｘｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｑｕａｌｉｔｙ ［Ｊ］． Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ２００２， ２０（６）：５３０-５４１．
2 u# @! B, h" V* I% V i! }6 r; y' J7 I* w! `; f. ^
% \. y. v8 e I% h E0 \( m
, c1 \3 V" W+ `7 Q# d Ｐｈｉｎｎｅｙ ＤＧ， Ｋｏｐｅｎ Ｇ， Ｉｓａａｃｓｏｎ ＲＬ， ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｔｉｃ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｉｎｂｒｅｄ ｍｉｃｅ： ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｙｉｅｌｄ， ｇｒｏｗｔｈ， ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈ， １９９９， ７２（４）：５７０-５８５．& q% C: W6 }6 N6 C
0 q I1 V2 R, _3 B S! O7 }5 @7 a/ L
* L" ~5 W: j( L& r i Ｐｈｉｐｐｅ Ｔ，Ｄａｎｉｅｌｅ，Ｎａｄｉｎｅ Ｐ，ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ［Ｊ］． Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， ２００４， ２９５（２）：３９５-４０６．
8 n- A- k! Z) {, H8 B1 K; y, _3 n' e
! Z. u+ E$ v$ O) D- S6 h' ~6 q' i8 K- I; P4 H3 t
: B3 l7 L# F6 q+ s. N
Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｐ， Ｊａｓｏｎ ＡＭ， Ｂｅｎｊｉａｍｉｎ ＬＬ， ｅｔ ａｌ． Ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｉｎｂｒｅｄ ｍｉｃｅ ｖａｒｙ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ， ｒａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］． Ｂｌｏｏｄ， ２００４，１０３（５）：１６６２-１６６８．
7 L( _% J3 \7 V" r$ r4 x+ J* o& R' \: h9 N
: A) j/ t- S. `* r/ P! |4 R1 R
7 y/ U6 K" E8 x! }; g J; r) _ Ｃａｒｌ ＡＧ， Ｄａｒｗｉｎ ＪＰ， Ｊｅｆｆｒｅｙ ＬＳ． Ｎｏｎ-ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， ２００５， ３０６（２）：３３０-３３５．) s- C* a* b1 A) G9 d! _
4 w$ [! Q# \) y/ O
+ b; U4 [* y; V
, [+ K/ v4 n- d2 |/ X0 d; G
Ｂａｋｓｈ Ｄ， Ｓｏｎｇ Ｌ， Ｔｕａｎ Ｒ Ｓ． Ａｄｕｌｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］． Ｊ Ｃｅｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， ２００４，８（３）：３０１-３１６．; ^5 S2 v8 e" i
: g' K/ Z4 D- s/ m
- {* c2 K0 Y( \) p6 |9 Y, r! Y- r2 f, R3 m! |+ p* R9 |
Ｈａｌｅｒｖｏ Ｈ． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｍｅｄ， ２００５， ３７（７）：４６９-４７９．2 x5 G8 l X v6 G! m$ Q
% {) e9 P1 u5 M9 K! Z3 s* H K8 U) ^, U
5 ^# c$ ]0 z% e/ K* g/ } 陈松林，张 成，黄 文，等．亚致死量放疗对Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良鼠骨髓干细胞移植的影响 ［Ｊ］．中山大学学报：医学科学版，２００３，２４（２）：１０９-１１２．# u/ {$ N/ a& X& X8 ?$ n0 ]
1 P' o; X+ x* x* V
* b" x# G1 e/ }6 m0 v/ F6 Z5 b
" R& Z. ^1 P; g7 R* o3 l, u; q 华 平，熊利华，张 华，等． 体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞［Ｊ］．中山大学学报：医学科学版，２００４，２５（１）：６７-６９， ７６．) @3 S0 I+ J/ F
( b' X+ u6 S8 _( P) t' M
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