|
  
- 积分
- 8
- 威望
- 8
- 包包
- 898
|
作者：陈君 7 t* G; X# w+ h# w1 U
8 e! O8 q! V, @, S% F / j& a3 j( L; q% j
. ]4 [3 t8 @) r* M* B5 H1 P
5 X5 T% v# P$ z# ^
9 m8 i. A& l: I7 j3 v" ]. Z
% z$ M- ^) u( q8 C6 d/ n
c7 _5 b" g/ k, E5 r8 U
8 ~# ?6 C; Q1 S7 B
- g: ^) `$ U3 @, S" L. Q
& T* ?8 ~9 ^3 y% y/ ]* B4 l) ?. T 8 W1 K' f" W" s6 q" o
* x8 j/ S' u6 I7 K
【关键词】胚胎神经干细胞;脊髓损伤;移植;轴突再生;大鼠( q0 S9 h- V/ a6 n: Y1 U
【摘要】 目的观察胚胎神经干细胞（neural stem cells，NSCs）对成年大鼠脊髓损伤（spianl cord injury，SCI）的修复及对轴突再生的作用。 方法制作20只大鼠SCI（T 7 ）模型，随机分为实验组和对照组。伤后2d实验组移植经全离培养的Wistar大鼠NSCs;对照组只注入DMEM培养液。移植后第1、2、4、6周经电镜及免疫组化观察移植对脊髓轴突再生的影响。 结果实验组NSCs与宿主融合较好，损伤区可见幼稚的呈束状排列的再生轴突;对照组轴突变性未见再生轴突。 结论NSCs植入异体大鼠打击伤后的脊髓可存活，并产生髓鞘样物质促进宿主脊髓轴突再生。 【关键词】胚胎神经干细胞;脊髓损伤;移植;轴突再生;大鼠 Transplantation of neural stem cells into injured spinal cord of adult rat ( M& r( ]# U4 a8 N* X6 M7 _$ \
CHEN Jun.! r3 i" l8 y8 x) L8 B: I3 D% z
Department ofLaboratory，Tianjin People Hospital，Tianjin300121 【Abstract】 Objective To observe the therapeutic effect of neural stem cells（NSCs）transplantation on spinal cord axonal regeneration.Methods Twenty rats were divided into two groups，10rats in each group.Two days after SCI models were made，NSCs suspension，purified from Wistar rats and transplanted into the injured spinal cords at T 7 levels，while the vehicle solution（DMEM）was injected in the control gruop.At1，2，4，6weeks after transplantation，the samples were procured and studied by electron microscope and immunohistochemical method.Results The morphology of translated NSCs was almost normal，and NSCs arrangement was good in the host.Axons could regrow into injured spinal cords.The axons regeneration was not found in the controls.Conclusion Transplantation of NSCs could integrate with the host and could promote the axons regeneration of host. 【Key words】 fetus neural stem cells;spinal cord injury;transplantation;axons regeneration;rats& b- a/ p' f U. F
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后再生能力受限主要是因为缺乏诱导、促进神经再生的微环境，而非损伤的轴突本身不具有再生能力。人们长期以来采用周围神经、神经胶质细胞和雪旺细胞移植等方法，在不同程度上促进脊髓神经轴突再生。NSCs在促进脊髓轴突再生方面是近年来继雪旺细胞研究之后的又一热点［1］ 。本研究是建立一个成年大鼠脊髓（T 7 ）损伤模型，于损伤处植入NSCs并观察其对轴突再生的促进作用。
; o1 x9 G f E- \7 C 1 材料与方法 1.1 动物及主要试剂 （1）孕14d雌性Wistar大鼠3只;体重230～250g成年Wistar大鼠20只。（2）细胞培养试剂及抗体DMEM.F12和B27添加剂;巢蛋白单克隆抗体（Nestin）;胶质纤维酸性蛋白抗体（GFAP）;神经元特异性抗体（NSE）等。 1.2 脊髓损伤模型的建立 Wistar大鼠20只乙醚吸入麻醉后俯卧位固定于手术台上，背侧正中切口，暴露T 7 椎板并切除，显露肌膜，按Allen打击法将打击头（直径2mm，重10g）置于硬膜上4cm处，使重物自然下落，打击量为40g-cm。迅速移开打击头，止血后逐层关闭伤口，复苏后饲养，每8小时挤尿1次，随机分为对照组和实验组各10只。 1.3 NSCs的分离和培养 取3只孕14d的雌性Wistar大鼠，乙醚吸入麻醉后取出胚胎剪开头皮和软骨，仔细剥离脑表面被膜，分离出大脑半球钳取大脑皮质及皮质下脑室旁的脑组织。置于PBS缓冲液内漂洗3欠，机械分离呈匀浆状，经200μm滤网过滤于内含DMEM.F12（1∶1）、B27添加剂的培养皿中。37℃、5%CO 2 孵育箱中过夜，隔日观察。 1.4 移植 将培养的NSCs行台盼蓝染色记数，细胞存活率85%～95%，用DMEM调整细胞浓度为（1.8～2.0）×10 6 细胞.ml备用。脊髓损伤模型建立2d后的大鼠沿原伤口暴露损伤脊髓，用自制微量注射器分别向头、尾共注放NSCs10μl;对照组仅于脊髓损伤处注相同剂量的DMEM培养液。 1.5 标本留取 对照组和实验组在移植后第1、2、4、6周后分别行主动脉插管灌注，切取T 4 ～T 10 脊髓标本，置固定液中行电镜检查与免疫组织化学染色检查。
; P; |2 j7 K6 E+ x9 o 2 结果 2.1 大鼠NSCs培养结果 在Olympus倒置相差显微镜下可见原代细胞培养2d后即大部分凋亡，仅少数细胞分裂形成2～4个细胞的细胞团。7d时发展成上百个细胞的大细胞团，呈悬浮球形，克隆传代后，部分细胞贴壁分化并在随后的继续培养中相继凋亡，在以后的连续传代中细胞克隆形成能力逐渐增强，分化凋亡细胞逐渐减少，台盼蓝染色记数，调整细胞浓度为2.0×10 5 .ml，7～9d传代1次。间接免疫荧光染色显示:Nestin抗原阳性（Nestgin为NSCs特异性标志）。 2.2 电镜检查结果 对照组2只动物死亡，存活率为80%;实验组1只动物死亡，存活率为90%，结果如下:（1）1周时:实验组可见髓鞘细胞变性、溶解、水肿，大量破裂、崩解的细胞器溢漏于组织间隙。NSCs存活且生长良好并与宿主的神经细胞及神经元突触连接，可见小而幼稚的突触形成;对照组髓鞘细胞变性、溶解、水肿，神经元坏死，突触小泡显著增多融成大片，可见弥漫性神经轴损伤。（2）2周时:实验组NSCs有明显与宿主的神经元接触连接，幼稚的突触形成，脊髓白质中可见NSCs出 现于崩解的脊髓神经之间，脊髓内可见创道;对照组情况与1周时相同。（3）4周时:实验组NSCs与宿主的神经细胞及神经元接触连接（幼稚的突触进一步形成），且与星形胶质细胞相连（后者胞浆内含大量微丝是否阻挡突触进一步形成尚需进一步观察），脊髓组织创道减少，裂隙开始缩小，神经破坏减轻，崩解的细胞器减少;对照组情况未见改善。（4）6周时:实验组NSCs不仅与宿主的神经细胞及神经元接触连接（幼稚的突触进一步形成），且与大量的星形胶质细胞相连，脊髓组织内创道及裂隙更加缩小，神经破坏减轻、崩解的细胞器几乎清除干净;对照组仍可见髓鞘变性，神经元坏死，可见弥漫性神经轴损伤，脊髓内创道略有减少。 免疫组织化学显示:移植区组织染色后除Nestin阳性外，NES及GFAP亦呈阳性。表明NSCs在脊髓损伤处不仅可以存活并且能够进一步分化，从而对损伤的脊髓进行修复。 2.3 免疫组织化学检查结果 实验组大鼠脊髓移植物自第1周开始;Nestin、NSE（神经元特异性标志）及GFAP（神经胶质细胞特异性标志）均呈阳性，说明NSCs在异体大鼠损伤的脊髓中不仅可以存活而且进一步分化，从而对损伤的脊髓进行修复;对照组大鼠第1～6周损伤的脊髓变性、坏死明显，只可见脊髓内创道略有减少，修复效果甚微。 3 讨论 脊髓损伤一直是困扰医学界的难题。NSCs具有自我更新和多向分潜能，因而当将其移植于中枢损伤部位时，NSCs可促进神经元及轴突再生，并越过移植物界面到达靶细胞建立突触连接。本研究结果显示，大鼠NSCs体外培养存活率高并可以增殖传代。Nestin、GFAP、NES免疫组化染色呈阳性，说明NSCs具有分化为神经元、神经胶质细胞等中枢神经细胞的能力，进而对损伤脊髓时行修复。 Okano［4］ 将干细胞移植于C 4、5 损伤9d的大鼠脊髓，5周后发现移植组较对照组前肢功能有明显恢复，组织学检查发现移植的细胞已分化为神经元、神经胶质细胞（包括星形胶质细胞、少突胶质细胞）填充于损伤的部位所形成的空洞。电镜检查还发现供体细胞与受体神经元形成了突触，这与本实验结果一致。本研究在损伤2d后植入NSCs细胞，更与临床实际接近。通过免疫组织化学与电镜检查显示:在移植后早期，损伤的脊髓组织中已呈现出轴突的再生和脊髓内创道的修复迹象;而未行细胞移植的对照组，损伤脊髓则呈现灶状液化与轴突断裂变性神经元坏死。结果显示，NSCs移植不仅可促进脊髓神经轴突的生长，而且对脊髓具有一定的保护作用。 总之，NSCs移植能有效地促进大鼠受损脊髓的神经再生和功能恢复，有望成为人类治疗脊髓损伤的新方法。 参考文献 1 Pallini R.Anatomy of regenerating axons.Science，1998，280:181-182. 2 杨波，杜英，张清勇，等.人胚胎神经干细胞的分裂与培养.河南医科大学学报，2000，35:504. 3 Filbin MT.Axon regeneration:Vaccinating against spinal cord injury.Curr Biol，2002，10:100-109. 4 Okano H.The application of stem cells in spinmal cord injury.Soc Neurosci2000-Conference.New Orleans，2000，6:85-86.3 B4 H5 }, Z3 G0 G. v
作者单位:300121 天津市人民医院检验科 |
|
发表于 2009-3-3 12:34
发表于 2015-5-21 20:55
