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作者：宋敬锋 张翼 白俊清（审校）
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【关键词】,,骨髓间充质干细胞；软骨；组织工程；转化生长因子β1
' p: ~! B p6 ^4 H9 O& M. t 关键词骨髓间充质干细胞；软骨；组织工程；转化生长因子β1+ }. T, m. {4 Y9 y4 \' B
干细胞是一种具有多分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞，它能在人体内分化成任何细胞类型。具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，已成为组织工程中首选的种子细胞［1］。早在1867 年，德国病理学家Cohnheim 通过实验推测骨髓内存在有非造血功能的干细胞，但直到20世纪60年代末才有了直接的证据。Friedenstein等［2］将整个骨髓标本放于塑料培养瓶上，4h后倒掉非贴壁细胞，剩下少量贴壁的细胞外观多呈纺锤形，且形成2～ 4 个细胞聚集的细胞灶,在2～4d内这些细胞处于休眠状态，随后便迅速增殖，几次传代后仍保持纺锤形，这些细胞最突出的特征就是能够分化成类似骨和软骨聚集物样的集落，Friedenstein将这些细胞称作骨髓多能基质干细胞，又称作骨髓间充质干细胞（MSCs）。
& w: X4 e) s1 P 1MSCs的生物学特性# ?. F1 m; x+ K( A
MSCs细胞体积小、核浆比例大，不表达分化相关的标志，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，碱性磷酸酶或骨桥接素。与造血干细胞等其他细胞相比，骨髓中MSCs的数量非常少，约占整个骨髓有核细胞的十万分之一，并随年龄的增加，细胞数量逐渐减少［3］。MSCs体外增殖能力强，成人一次抽取10ml骨髓，即可达临床所需细胞数量。Conget等［4］发现人MSCs中约有20%处于静止期(G0期)，足以维持增殖分化所需的细胞供给。体外培养扩增中，不自动分化。观察表明人MSCs体外12次传代后仍能保持正常的染色体组型和端粒酶活性［5］。具有多向分化的能力是其另外一个特征。研究证实，MSCs在适宜的体内或体外环境下，不仅可分化为间充质组织，还可以保持内外胚层的组织发育分化潜能，可以分化成神经系统、肝、肺、上皮组织等。因此，有人认为MSCs可能是保留于成年组织器官中的胚胎干细胞或者MSCs具有胚胎干细胞的特征［6，7］。Jaiswal等［8］证实，成人MSCs适宜条件下能够通过分化形成多种中胚层组织，包括骨和软骨组织、肌腱、肌肉、脂肪组织以及骨髓基质结缔组织。研究证明胚胎骨髓基质干细胞较成人的幼稚, 具有更强的自分泌因子以维持自身生长及分化的能力［9］。MSCs可分泌多种细胞因子如IL-6（白介素-6）、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、集落刺激因子(CSF-1)、干细胞生长因子、多种粘附分子等［4］。一直以来MSCs被视为非单一的混合细胞群，还没有用于鉴定的理想标志性分子或方法,不具备典型的形态特征，MSCs的表面抗原并不独特，它既有间质细胞的表面抗原特征，又具有内皮细胞、上皮细胞和肌肉细胞的表面抗原。另外由于在分离、纯化MSCs时所用方法不同,所获得的细胞类群也不一致。所以，目前对于MSCs的表面标志物尚无确定结论，一般认为，它对SB-10、SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a和CD124［10-12］等都呈阳性反应，而CD1a、CD31、CD34、CD14、CD45、CD56、ESA等造血谱系标记则为阴性。近年来的研究还发现，MSCs易于外源基因的导入，是基因治疗的一种合适的靶细胞。无论是逆转录病毒载体还是腺病毒载体均可携带目的基因成功转染MSCs，并在体内长期高效地表达。将携带人类胶原Ⅰ基因的转基因小鼠的MSCs移植到受体鼠体内，发现5个月后在骨、软骨、肺、脾和骨髓中均有外源基因的表达，表达率在12%~15%之间［13］，这一研究显示MSCs携带基因的表达具有组织特异性。Allay等［14］研究发现，人类MSCs转染了携带了LacZ和IL-3的逆转录病毒载体后仍可保持原来的未分化特性，输注到SCID小鼠体内可分化为成骨细胞和骨细胞，并可检测到IL-3的表达。
5 |5 U! r8 ~ S$ h+ O. {8 f' W o 2MSCs的分离、培养
$ S6 C8 I6 c7 J- U MSCs在骨髓中的含量不高，约占有核细胞的0.001%～0.010%［15］，因此进行分离纯化和体外扩增就显得尤为重要。MSCs最初的分离培养方法由Friedenstein［15］于1976年建立，主要通过贴壁培养进行细胞分离，但是所得细胞成分复杂，MSCs的纯度不足。目前对于骨髓中MSCs的分离、纯化、培养还没有统一的方法，比较常用的方法主要有4种，即全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪(FACS)法和免疫磁珠分离(MACS)法；由于目前尚未发现MSCs特异性的表面标志分子，而且FACS和MACS实验条件要求高，需要骨髓量多，对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性，因此很难应用FACS和MACS对其进行分选；密度梯度离心法是根据骨髓中各细胞成分的比重不同而分离MSCs。贴壁细胞分离法是根据骨髓MSCs贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行分离，但所得的细胞成分复杂，骨髓MSCs的纯度不足，作为组织工程的种子细胞，细胞的纯度越高越好，因此尽管密度梯度离心法操作较贴细胞分离法稍繁，但细胞纯度较后者高，更符合组织工程研究的要求。有报道［16］通过密度梯度离心分离培养的MSCs在第一代时纯度达95%，第二代超过98%。MSCs的体外扩增与种植密度关系很大，David等［17］报道人的MSCs如果以较低的细胞密度(1.5~3.0个细胞/cm2)培养可以更快地增殖，鼠的MSCs比人的MSCs对细胞密度更加敏感，当鼠MSCs以2个/cm2细胞培养时，细胞数在12d内增殖4 000倍，超过人MSCs增殖速度的2倍［18］。
2 J% ^3 K2 M2 @5 ^( y* w' U 3MSCs介导的组织工程+ t& p" f8 g6 L9 M
软骨构建及软骨缺损的修复组织工程学是20世纪80年代末发展起来的一门新兴边缘学科。其综合应用工程学和生命科学的基本原理、理论和技术，在体外预先构建有生命的种植体，然后植入体内修复组织缺损，替代组织器官的一部分或全功能。软骨为单一细胞构成组织，具有重要的功能，组织工程软骨的构建获得足够的种子细胞及制备性能优良的支架材料是二大关键问题。种子细胞可选软骨细胞和干细胞二大类，软骨细胞中自体软骨细胞来源有限，切取软骨增加伤残，而异体软骨细胞存在传染病和移植免疫的危险。因此，干细胞中的MSCs固有的优势和特性将在软骨组织修复中成为首选种子细胞, 可通过取自体且体外扩增的MSC回植自体内修复重建软骨组织缺损。将MSCs应用于软骨组织工程已成趋势。MSCs 在体内定向成软骨的能力早已被证明。Nevo［19］比较不同的干细胞对软骨缺损的移植修复效果，发现自体MSCs获得100%的成功率，异体胚胎干细胞修复成功率为75%，而异体MSCs仅有31%的成功率。与软骨损伤后其周围的环境能诱导干细胞定向分化, 使损伤得到修复。有研究［20］发现，将骨髓来源的MSCs植入体内后，能向软骨分化。而在体外培养条件下软骨表型的分化却是多种因素限制的复杂过程。基础培养基、细胞密度、空间组织、机械力、生长因子和细胞因子等均可影响MSCs的定向分化。目前认为，离心处理使之聚集成团是MSCs向软骨细胞分化的必要条件，因为细胞团块便于自分泌与旁分泌作用，更符合软骨生长的要求。应用高糖DMEM 培养基对骨髓MSCs分化为软骨细胞具有明显的促进作用。因为有利于骨髓MSCs存活，软骨细胞和MSCs在体外单纯培养中会逐渐凋亡，高糖培养基可改变细胞新陈代谢，从而降低对凋亡的敏感性［21］。细胞分化需要细胞与细胞、细胞与细胞基质间相互作用。在转化诱导刺激物方面，地塞米松并不是一个特异的诱导物。多项实验表明在地塞米松的作用下，MSCs可以向骨、软骨、脂肪甚至肌细胞等方向分化［18，22，23］。Critchlow［24］于动物的骨膜下注射TGF-β1后观察到软骨的形成。O’driscoll［25］在体外培养的骨膜细胞中加入TGF-β1后，可诱导其分化为软骨细胞。TGF-β1在MSCs定向分化为软骨细胞的过程中起到了非常关键的作用。TGF-β1能诱导MSCs转化为软骨细胞，同时对软骨细胞的分化和功能具有双向调节作用，促进未分化或分化早期软骨细胞DNA 合成、增殖、分化及细胞外基质的合成，抑制成熟软骨细胞的增殖和分化。在含TGF-β1的无血性培养基上培养，10～14d可获富含大量糖蛋白和Ⅱ型胶原的软骨细胞［5］。Naumann等［26］将分离的人骨髓MSCs体外培养21d，消化离心后置入含高糖DMEM、TGF-β1、VitC和地塞米松等的特殊软骨起源的培养基中。结果三维培养3周，组织学和免疫组化证实细胞表达软骨特异的Ⅰ、Ⅱ 型胶原和蛋白聚糖。从而认为，人骨髓MSCs在含生长因子的特定培养条件下有能力分化成软骨细胞。单玉兴［27］观察到，有时单纯加入TGF-β1也可使MSCs发生软骨转化，但明显不如复合诱导作用强。由此可见，TGF-β1在MSCs生成软骨诱导分化中发挥重要作用，其作用机制目前尚不清楚。VitC可使细胞分泌的基质和胶原纤维有机的组成与排列，构成一个特殊的环境，利于细胞发生自分泌与旁分泌作用，保证内外源因子的传输，在局部贮存和清除重要的活性物质，具有非特异的促进细胞增殖与转化的作用，其本身并不能使MSCs发生转化。bFGF是一种能广泛促进来源于中胚层和神经外胚层细胞增殖的生物活性物质。bFGF对软骨细胞既是丝裂原又是形态发生因子。培养的软骨细胞在bFGF作用下才能保持其分化形态，产生硫酸软骨素蛋白聚糖、Ⅱ型胶原，否则很快变成成纤维细胞样外观，不能分泌硫酸软骨素蛋白聚糖、Ⅱ型胶原。但是只有bFGF作用MSCs并不能向软骨细胞转化，由此可见TGF-β1在诱导中起主要作用，而bFGF在试验中起辅助作用，二者有相互促进作用。MSCs发生软骨起源转化前都要经历一个立体增殖过程，然后在细胞高度密集区才发生转化。单玉兴［27］在诱导的第一周先加入丝裂原活性较强的增殖刺激因子bFGF，使MSCs发生迅速增殖。然后再加入转化生长因子TGF-β1，比一开始就加TGF-β1更容易使MSCs发生转化，说明MSCs在转化前应有一个最低的细胞数要求。有支架细胞培养是十分重要的研究内容和热点之一。O’driscoll［25］在体外观察骨膜细胞成软骨分化中也发现，如将骨膜细胞放入含胶原凝胶或琼脂糖凝胶的立体环境下培养，没有外源因子的作用也可发生部分软骨转化。立体环境可使细胞与细胞之间、细胞与基质间发生有机的结合，限制其扩散生长趋势、利于自分泌与旁分泌的作用，在局部产生了足以使其发生转化的内源因子，因而有效的立体环境可能是其转化的一个关键因素。Yoo等［28］对体外单层或细胞聚集球培养下的成人骨髓MSCs进行比较，发现在其他条件相同时，三维培养的骨髓MSCs发生了定向软骨分化，而单层培养，则无软骨形成。三维立体环境能容纳高密度的细胞粘附、增殖，有利于细胞间信号传递，为维系细胞的代谢活动提供适宜的微环境。研究证实，通过离心让细胞聚集成团是诱导MSCs向软骨细胞分化的必要条件。在不让细胞聚集成团的情况下，用同样条件培养基培养的细胞却不能分化为软骨细胞。Martin 等［29］首先将鸡胚MSCs经单层培养扩增后接种与PGA支架上，培养4周生成了软骨组织。Ponticiello等［30］将成人骨髓MSCs接种于明胶海绵，在加入10ng/ml的TGF-β3培养基中连续培养21d,产生Ⅱ型胶原和糖胺聚糖。并在植入与兔的骨软骨缺损处观察到很好的生物相容性，无免疫反应和淋巴细胞浸润的证据。董启榕等［31］抽取兔骨髓体外扩增后,与Ⅱ型胶原凝胶载体结合，植入兔关节缺损中，获得透明软骨样修复，修复软骨与周围组织连接良好。并认为Ⅱ型胶原作为载体较Ⅰ型胶原效果好。这可能是由于软骨基质的胶原成分主要为Ⅱ型，用Ⅱ型胶原凝胶作为载体更接近软骨细胞所处的生理环境，从而更有利于骨髓MSCs向软骨细胞的分化以及软骨细胞的增殖和生物学性状的保持。
$ g3 ]( f2 E6 x4 J. a 4存在问题及展望
: w2 t1 Z4 X- p5 g 作为细胞移植的细胞源，MSCs具有独特的优越性：①骨髓组织取材容易，可以通过穿刺获得。②骨髓干细胞分离扩增方法简单，成人的MSCs仍保持了多方向分化的潜能。③可以用于自体移植，避免的排斥反应和疾病传播。④人骨髓干细胞移植的方法已经经过临床验证［32］，实验研究更接近临床应用。MSCs及其在软骨组织工程方面的研究虽然已取得了较大进展, 但仍有许多问题有待解决：①获得纯化的MSCs，有待于对MSCs的细胞学特点及分化各阶段细胞标志物的研究；②保持MSCs体外大量扩增后多能干细胞的生物学特性；③寻找MSCs 增殖、分化合适的条件，如何既控制增殖，又能在适当的时候调控MSCs定向分化为成熟软骨细胞,并抑制其向肥大软骨细胞分化；④合适的载体，促进MSCs与理想载体支架相容生长并成软骨；⑤MSCs构建组织工程软骨的环境、力学研究。虽然有这些问题，由于MSCs具有自我更新及多向分化能力，易从骨髓中分离纯化和体外扩增，便于自体移植、无免疫反应等特点，近年来在组织工程领域中倍受重视。随着MSCs及其在软骨组织工程中研究的不断深入，相信组织工程软骨将成为软骨缺损修复的最有效方法。
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