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作者：王家增作者单位：山东大学医学院人体解剖学教研室， 山东 济南 250012 3 P7 C j, f, r$ Q; f7 k2 |% U. K
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【摘要】 目的：观察GFP转基因鼠胚胎神经上皮干细胞的体外培养及脑内移植后的存活与分化状况。 方法：将GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞置于无血清培养基内纯化扩增，用巢蛋白免疫组织化学染色鉴定神经干细胞，将扩增后的含GFP基因的神经干细胞在立体定位仪下，定向移植到大鼠的纹状体内。术后不同时期取材、切片，在荧光显微镜下观察移植细胞的存活状况，行微管相关蛋白（MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色鉴定移植细胞的分化状况。结果： GFP转基因鼠神经管来源的神经上皮干细胞在无血清培养基内能增殖形成神经球，呈巢蛋白阳性。纹状体内移植2周、4周均可见明显的呈绿色荧光的移植细胞，显示细胞存活良好。免疫组织化学染色显示移植细胞在不同间隔时间可分化为MAP2、GFAP及TH阳性细胞。结论： GFP转基因鼠来源的具有GFP标记的胚胎神经上皮干细胞可在体外培养扩增，移植到大鼠纹状体内存活良好并能分化成神经元、神经胶质细胞，且能定向分化为多巴胺能神经元。 * p2 L! W9 Z5 C$ W1 A0 O1 ]7 a7 ~
【关键词】小鼠 转基因 神经上皮 干细胞 增殖 移植
; K2 y" K2 P8 T8 v" _. U$ c ASurvival and differentiation of GFP transgenic micederived H2 _0 @( y1 V7 J, H8 b
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neuroepithelial cells after beingtransplanted into rat brains
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WANG Jiazeng， BAO Lihua， SUN Jinhao， LI Zhenhua， ZHANG Jing s1 U4 @3 c8 G J( E2 r' M4 ]
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(Department of Anatomy， School of Medicine， Shandong University， Jinan 250012， Shandong,China)% N$ `0 j5 s# l0 Y
' v+ Q0 U! f) |9 m- _9 i2 q! x［ABSTRACT］Objective: To observe the survival and differentiation of cells derived from the embryonic neural tube of green fluorescent protein (GFP) transgenic mice after being transplanted into the striatum of rats. Methods: Neuroepithelial stem cells derived from the embryonic neural tube of GFP transgenic mice were cultured and depurated in free serum medium containing B27, bFGF and EGF, and then they were directionally transplanted into the striatum of rats. Animals were sacrificed atdifferent time points after being transplanted and frozen sectioned, and staining by MAP2, GFAP, and TH was determined by immunohistochemical techniques. Results: Neuroepithelial stem cells derived from the embryonic neural tube couldexpand into neurospheres in the free serum medium and express nestin. The grafted regions were clearly visible, and the transplanted cellssurvived well and some of them differentiated into THpositive cells. Conclusion: Embryonic neuroepithelial stem cells from GFP transgenic mice could be generated in vitro, survive and differentiate into neurons, especially dopaminergic neurons and neuroglia cells after being transplanted into rat brains.1 v$ Y$ E6 k3 f
+ [3 }# U e' L9 J［KEY WORDS］Mice, transgenic； Neuroepithelium; Stem cells; Proliferation; Transplantation
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神经上皮干细胞(neuroepithelial stem cells，NSCs)是神经系统发育过程中最早出现的神经干细胞，具有活跃的自我增殖能力，可分化为神经元和神经胶质细胞，免疫原性低，移植后能与宿主组织良好的整合。此外，NSCs还具有很强的迁移能力，对炎症和损伤有良好的趋向性［1］。因此， NSCs有可能成为神经源性疾病细胞替代治疗的良好供体。8 P4 E& i/ X5 l* _" r3 g1 L
) P/ g( z- p3 r; A. b我们曾取材胚胎神经上皮干细胞，进行侧脑室移植的实验［2］，在移植区内可以检测到存活的移植细胞及其分化的神经元；也曾进行过神经干细胞脑内移植治疗帕金森病的研究［3］，但移植的细胞未做标记。本实验从GFP转基因鼠取材神经上皮干细胞，这些细胞能携带GFP基因，便于追踪检测。将其移植到纹状体内，以便进一步探讨神经上皮干细胞作为供体细胞进行脑内移植治疗帕金森病的可行性。
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8 E+ a0 {* }+ ]' J! H6 f1材料与方法" s8 U5 L" ~5 {+ y$ }
$ Y5 P. ?( O7 s4 H) q1.1材料成年雄性Wistar大鼠，体重180 220?g，由山东大学实验动物中心提供；GFP转基因鼠胚胎神经上皮干细胞由香港中文大学路钢博士惠赠；DMEM/F12、B27系Gibco公司生产；bFGF、小鼠抗大鼠TH单克隆抗体系Sigma公司生产；兔抗人Nestin系Santa cruz公司生产；小鼠抗大鼠MAP2，兔抗人GFAP、FITC羊抗兔IgG、罗丹明羊抗小鼠IgG均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。
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1.2方法
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' A2 t. L6 l$ P1 d7 t7 B+ z1.2.1神经上皮干细胞的培养、扩增及鉴定将来源于转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞按1105个/ml种入培养瓶中，加入神经干细胞生长培养液（成份：DMEM/F12 B27 bFGF，其中，B27：1:50；bFGF：10?ng/ml）。3?d时半量换液，5 7?d有大量神经球形成。取形状规则的神经球进行传代。用吸管在原代培养瓶中轻轻吹打, 使沉在瓶底而没有贴壁的神经球浮起, 并将所有培养液吸入10?ml刻度离心管中,垂直静置15?min，随后将沉在刻度离心管底部的神经球收集到另一1.5?ml离心管中，机械分离法制成细胞悬液，800?r/min离心5?min，吸去上清，加入1?ml无血清培养液吹打成单细胞悬液,并用计数板计数, 按1105个/ml接种到培养瓶中，培养液同上，继续培养。以后每7?d传代1次。& j. t* S: P- f# ~* f
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选取形状规则的神经球接种到两块预先置有多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中, 加入不含胎牛血清的培养液孵育，2?h后取其中的一块6孔板，PBS缓冲液冲洗、加4%的多聚甲醛固定后进行巢蛋白(Nestin)染色鉴定。另一培养板中加入10%的胎牛血清继续培养，中间换液1次，共培养7?d，PBS缓冲液冲洗、4%的多聚甲醛固定后行酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）染色鉴定。
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1.2.2纹状体内移植取第5 7代神经球移入离心管内，制成细胞悬液，计数板计数，调整细胞浓度为2107个/ml，置于4?℃冰箱待用。
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7 R, V6 s1 A9 w+ Y8 s+ Q+ V选取体重在180 220?g之间的成年健康雄性Wistar大鼠，1.5％戊巴比妥3?ml/kg腹腔麻醉后，在脑立体定位仪下，向右侧纹状体分两点移植，坐标为：第1点：A（前囟后） 0.7?mm，L（旁开）-2.5?mm，D（深度）5.5?mm；第2点：A（前囟后）-0.3?mm，L（旁开）-3.5?mm，D（深度）5.5?mm。每点注入细胞悬液5?μl，约1105个细胞，注射速度1?μl/min，3?min后暂停2?min，注射器退出1?μm，再以同样的速度将剩余的细胞完全植入，留针5?min。正常饲料喂养。8 q9 U; |) f. A* q: ^- H
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1.2.3取材、固定、切片分别在移植后2周和4周时，用1.5％的戊巴比妥腹腔麻醉，4%的多聚甲醛PBS溶液经左心室灌注固定。取出脑后置于同样的固定液固定12?h,然后移入含25%蔗糖的磷酸盐溶液内过夜，-70?℃超低温冷冻，-20?℃恒冷连续冰冻冠状切片，厚度为20?μm，均直接置于荧光显微镜下观察移植细胞的存活状况。
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1.2.4免疫组织化学染色取含有移植区的组织切片进行免疫组织化学染色。切片经PBS缓冲液洗后，置于3%的H2O2(甲醇稀释)中室温30?min，滴加triton X100BSA (含0.3% triton X100, 1%BSA) 室温30?min;正常马血清封闭,室温30?min；分别滴加多巴胺能神经元特异性TH单克隆抗体(1∶2000)、神经元特异性MAP2抗体和星型胶质细胞特异性GFAP抗体，置湿盒内4?℃过夜；再分别滴加相应的罗丹明抗体，甘油碳酸氢盐缓冲液封片。除马血清封闭后其余各步骤间均用0.1?mol/L的PBS缓冲液（PH:7.4）冲洗3次，每次5?min。) i9 ~$ d6 b& k3 j6 k3 F% p6 V
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2结果/ l" [9 |% O3 |- @4 l
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2.1GFP转基因鼠神经上皮干细胞的培养转基因鼠胚胎神经管神经上皮干细胞接种在无血清干细胞生长培养基内24?h后便可见细胞分裂相,见图1。3?d时可见由几十个细胞构成的神经球悬浮生长，5 7?d时神经球数量增多，形体增大，大的神经球约有几百个细胞，见图2。传代后，细胞增殖加快，神经球的形成率增高。第1代神经球Nestin染色鉴定结果呈强阳性，见图3。加血清分化培养后，神经干细胞可分化成TH阳性细胞，见图4。
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6 _$ [9 U$ G* P; j( q基因鼠来源的胚胎神经上皮干细胞悬浮培养24?h所见的细胞分裂相(200)6 h+ o9 t! U U
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2.2荧光显微镜观察扩增后的转基因鼠胚胎神经上皮干细胞植入大鼠纹状体内后，分期取材，荧光显微镜直接观察，在2周的组织切片上可见明显的移植区。移植细胞在荧光显微镜下激发出强烈的绿色荧光，见图5。表明移植细胞在宿主体内存活良好，部分细胞向周围伸出突起，与宿主细胞建立了联系。有些细胞还进行了较远距离的迁徙，在移植区100?μm以外的组织中可见迁移出的单个细胞。术后4周的组织切片中，移植区内移植细胞的神经元形态更加明显，突起较长，移植细胞间以及移植细胞与宿主细胞间密切接触，有较多的细胞沿白质排列，前后相续，见图6。神经球接种于涂布多聚赖氨酸的盖片上，在分化培养基中培养7d后，分化成的TH阳性细胞$ z9 k( R$ i3 @* V
w5 b& m7 k2 s; _A: 荧光显微镜下分化细胞的形态(300)； B: 免疫组织化学染色呈TH阳性(300)； C: A、B合成的图像(300)# \% l7 f& z7 L" M f' T
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2.3免疫组织化学染色结果免疫组织化学染色显示，术后两周未检测到MAP2、GFAP阳性细胞；术后4周移植区内可见MAP2和GFAP阳性细胞，在纹状体内还可检测到TH阳性细胞，见图7 9。
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1 [3 r' P8 A9 J$ F0 U; u6 q; O3讨论
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神经干细胞移植治疗神经损伤和神经细胞退行性疾病已成为干细胞研究中的一个热点。神经干细胞在移植部位能否长期存活，能否分化为所需要的神经元并修复受损的神经功能，及之后的免疫排斥如何克服，移植细胞的来源和移植的时间，这些问题是这一研究领域中的难点。本研究以绿色荧光蛋白转基因大鼠的胚胎神经上皮干细胞为移植细胞，首先通过实验确认了这种细胞的神经干细胞特性，然后利用其永久性GFP标记的特殊优势，作为可示踪术后2周的组织切片在荧光显微镜下直接观察到的存活的移植细胞(300)$ _7 e# V# |3 x/ w+ ~
1 O1 K2 b! M8 t7 K* N8 H0 SFig.5The surviving transplanted cells at the grafted region at 2 weeks(300)The surviving transplanted cells at the grafted region at 4 weeks migrateed along the white matter (300)的移植细胞进行了同种纹状体内移植，观察了移植细胞存活和分化状况。实验结果显示，取自胚胎神经管的神经上皮干细胞植入同种动物的纹状体后，可以存活，并能分化为多巴胺能神经元，可用于干细胞移植治疗帕金森病等神经系统疾病。〖HJ0.8mm]〖KG*3]图7术后4周移植细胞在宿主纹状体内分化成的GFAP阳性细胞(300)& t' l6 Z$ Z! |5 r. Q
6 m$ W4 _5 o- k* r9 O, T1 e 良好的移植细胞是确保干细胞移植研究成功的关键。此前的研究证实，越年轻的干细胞生命力、组织相容性越强，越适合于移植［46］。而发育生物学研究表明哺乳动物的胚胎神经管壁上的神经上皮干细胞是最原始的神经干细胞，可在不同环境的诱导下分化出各种成熟的神经细胞［7，8］。本实验采用的是孕11?d GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞，是早期的神经干细胞。在体外干细胞生长培养液内培养3?d时可见大量由十几个到几十个细胞构成的神经球，5 7?d时神经球明显增大，表明携带GFP基因的神经干细胞仍具有活跃的增殖能力。在干细胞分化培养液内分化培养7?d，即可分化成TH阳性细胞，足见这类细胞良好的分化能力。& s- }/ ^* F/ L
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宿主组织中移植细胞的寻找和鉴定是干细胞移植研究的重点和难点。在以往的研究中，由于移植细胞难以标记，研究者们很难确定移植区内细胞的来源［9］，更难判断有无细胞进行了长距离迁徙。我们实验室曾进行过胚胎神经上皮干细胞原代移植治疗帕金森病的实验研究［3］。在移植区内发现了大量存活及呈TH阳性的细胞，但是移植细胞未进行有效的标记。为了克服这一难点，我们在本次实验中，采用了GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞。GFP转基因鼠是将GFP基因通过基因工程技术转染到受体鼠的遗传基因DNA序列中的，因此，GFP基因会随着细胞分裂增殖而传递到子代细胞中，且终身存在。这些细胞本身携带的增强型绿色荧光蛋白在共聚焦显微镜或荧光显微镜下，能激发出明亮的绿色荧光，从根本上解决了细胞标记难的问题。在实验中，我们将没经任何处理的20?μm厚的组织切片直接置于荧光显微镜下观察，找到了激发出强绿色荧光的细胞。在术后2周的宿主脑组织切片中，移植区内有大量细胞存活，且长出了突起，有些细胞还迁徙到了100?μm以外的组织中；4周的组织切片中较多的细胞沿白质迁移出移植区达200?μm以上。根据GFP基因对细胞的永久性标记可以确定这些细胞或是移植的或由移植细胞衍生的细胞。& |/ H& D, D; S1 d
6 V1 a* V3 A1 Q; A& [4 Z最近的研究证明，经过体外培养、扩增的移植细胞较原代移植细胞的免疫原性低，在宿主体内存活更好，生存时间更长，与宿主整合的能力更强［10］。这种现象被认为是细胞在体外扩增过程中缺乏抗原呈递细胞等免疫细胞的参与，使扩增后的细胞很少携带抗原，而原代组织中含有较多的抗原性细胞所致。本实验采用GFP转基因鼠来源的神经上皮干细胞体外扩增后，移植到同种大鼠的纹状体内。整个实验过程中没有施加任何免疫抑制因素。取材后，我们将未经任何处理的组织切片直接置于荧光显微镜下，观察到了能激发出强绿色荧光的细胞，免疫组织化学染色显示，移植细胞分化成了MAP2、GFAP和TH阳性细胞等成熟的神经细胞。与此相应，文献［9］中将胚胎中脑神经板的组织块直接移植到同种宿主的纹状体内，结果只有通过GFP抗体特异性结合后才能观察到移植细胞，说明细胞的活性较低，本身的GFP基因表达较弱。由此可见，经体外扩增后的神经上皮干细胞更适合作为细胞移植的供体。
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为进一步论证神经上皮干细胞脑内移植治疗帕金森病的可行性，本实验将GFP转基因鼠的神经上皮干细胞移植到受体鼠的纹状体内，术后分期取材、免疫组织化学染色鉴定，发现移植的神经上皮干细胞可在宿主的纹状体内分化为TH阳性细胞。纹状体是黑质多巴胺能神经元的靶组织，含有多种促使神经元存活、分化的营养物质。我们推测正是纹状体的微环境诱导神经干细胞分化成了多巴胺能神经元。7 |* }" O$ E* q, L' P2 d
8 \& u# P, U0 k; T! K综上所述，本实验采用GFP转基因鼠神经上皮干细胞进行的干细胞移植实验证明，神经上皮干细胞具有活跃的增殖能力，纹状体内移植后存活良好，并可定向分化为多巴胺能神经元，可以作为帕金森病脑内移植治疗的良好供体。* b7 h$ W" p4 r
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发表于 2009-3-3 12:32
发表于 2015-5-21 21:43
