显微操作在脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤中的应用 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:30 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：尹文化，金大地，鲁凯伍，闫慧博，王  璐，邓许勇作者单位：南方医科大学附属南方医院脊柱外科，广州 & i: j$ s0 H. T. b7 H, U
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      【摘要】  ［目的］建立大鼠脊髓全横断损伤模型，应用显微操作方法和人脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤，观察显微操作技术对大鼠受损脊髓功能恢复的影响。［方法］取足月健康顺产新生儿脐血，分离、培养脐血干细胞。60只SD雌性大鼠，随机分为假手术对照组（A组，n=10）、实验对照组（B组，n＝10）、常规治疗组（C组，n=20）和显微治疗组（D组，n=20）。A组大鼠只打开椎板；B、C组大鼠采用常规方法行T8～9平面脊髓全横断，造成急性脊髓损伤，C组大鼠于脊髓两断端用1 μl注射器分别注射脐血干细胞悬液1 μl（干细胞浓度为6×109/L ～7×109/L），B组同法注射等量PBS液；D组采用显微操作技术行脊髓横断，并以口径50 μm的毛细玻璃针用相同方法注射脐血干细胞。术后1～8周内每周进行1次后肢BBB评分，术后第8周处死大鼠，对比观察术中和术后第8周各组大鼠脊髓大体标本外形、颜色、质地和体积大小改变。［结果］A组大鼠手术前后运动功能、脊髓大体标本未见明显变化。B、C、D组大鼠术后双侧后肢完全性瘫痪，B组大鼠无明显恢复。而C、D组大鼠，从术后第2周开始逐渐恢复部分后肢运动功能。第3周以后，D组大鼠后肢运动功能BBB评分明显优于C组，具有显著性差异（P
      【关键词】显微操作；  脊髓损伤；  脐血干细胞；  移植' g5 F3 G1 U+ }2 X1 `6 L8 I7 m
   Micromanipulation used in surgical procedure of transected spinal cord treated with umbilical cord blood stem cells grafts in rats∥YIN Wenhua,JIN Dadi,LU Kaiwu,et al.Department of Spinal Surgery,Southern Hospital Affiliated to Nangfang Medical University,Guangzhou 510515,China6 _, _3 f7 [1 i1 D' k7 \' O; O% O

Abstract：［Objective］To establish effective and reliable complete spinal cord transection models in rats, and to investigate the effects of micromanipulation used in surgical procedure of transected spinal cord treated with human umbilical cord blood stem cells (UCBSCs) grafts in rats.［Method］Human UCBSCs were obtained from umbilical cord blood of term deliveries.Sixty SpragueDawley (SD) female rats were divided randomly intogroup A(control group), group B(spinal cord transection and PBS injection), group C(spinal cord transection and UCBSCs transplantation) andgroup D(spinal cord transection and UCBSCs transplantation by using micromanipulation).All groups were operated, and 1 μl UCBSCs（6109/L ～7109/L） were injected into the both ends of the completely transected spinal cord at thegroups C and D by two different surgical procedures respectively. From 1 week to 8 week postoperation, a behavioral testing was performed weekly upon each hindlimb for all animals according to the BBB scoring system. At the 8th week, all animals were sacrificed and the spinal cords were taken out for morphological observation. ［Result］No changes were observed at group A pre and postoperation. After 2 weeks postoperation, the hindlimb motor function of groups C and D began to recover. After 3 weeks postoperation, thegroup D showed more improvement thangroup C, and the difference betweengroups D and C were significant in the BBB scores(P- U* H5 G7 Z/ ?6 U: Q# G% y# D
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Key words：micromanipulation;spinal cord injury;umbilical cord blood stem cells;transplantation

　　脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）严重影响患者的生活质量，促进SCI后脊髓神经和轴突再生，在一定程度上恢复双下肢感觉和运动功能，一直是医学界努力的方向。多种干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究已取得一定进展，但疗效尚不理想，除却进一步探索更理想的种子细胞，操作方法的选择也是影响疗效的一个重要因素。人脐血干细胞来源广泛，具有分化成包括神经细胞在内的多种组织细胞的潜能［1、2］，有望成为脊髓再生研究中移植细胞的良好替代品，具有较好的应用前景。本实验建立了大鼠完全性脊髓横断模型，并对采用不同操作方法治疗大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复和脊髓大体形态学变化进行了对比研究。. W1 t) y8 T6 a3 y# D9 V
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1材料与方法

1.1主要实验材料微型不锈钢薄唇枪钳（枪头2 mm1.5 mm，唇厚0.15 mm）、微型神经剥离子（宽1 mm、1.5 mm各1把，唇厚0.15 mm）和用上海吉列刀片改制的超薄手术刀片（刀片厚50 μm）由广州器化医疗设备有限公司代为加工制造。显微镊和微型自动牵开器购自广州市金路工贸有限公司。甲基纤维素5 g/L（美国Sigma公司,），低糖－DMEM培养基（Hyclone公司）；FBS（Gibco公司），淋巴细胞分离液（比重1.077 g/ml，天津生物制品研究所）。抗人CD29、CD34、CD45、CD105、CD106单克隆抗体（深圳晶美公司）, EpicsXL II型流式细胞仪（Beckman Coulter公司）。1 μl微量注射器购自上海高鸽工贸有限公司。毛细玻璃针由南方医科大学生理教研室提供。手术显微镜（云南SSX型），立体定向仪（Narishige SR－6），倒置相差显微镜、荧光显微镜（日本Olympus产品）。实验主体在南方医科大学生物材料研究所（广东省重点实验室）完成。
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1.2实验动物与分组　　雌性SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供（许可证号SCXK(粤)2006－00152006B023）。随机挑选60只成年雌性健康SD大鼠，体重230～270 g，平均（236±6.78）g，随机分成4组，其中A组（n=10）只打开椎板，为假手术对照组；B组（n=10）行完全性脊髓横断＋PBS断端注射；C组(n=20)行完全性脊髓横断＋脐血干细胞移植，D组(n=20)在显微操作下行完全性脊髓横断＋脐血干细胞移植。对死亡大鼠模型，分析死亡原因，并及时予以补足。1 N( \4 b6 M6 H6 Q  \: T
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1.3大鼠脊髓全横断模型的建立和人脐血干细胞移植　　大鼠用100 g/L水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于手术台上，无菌条件下以T9椎体棘突为中心，纵行切开约2 cm，钝性分离棘突两侧椎旁肌达椎板表面，微型自动牵开器牵开两侧椎旁肌，暴露椎板和椎体棘突，咬除T8～10椎体棘突。微型神经剥离子钝性分离T8～10椎间黄韧带，微型枪钳咬除T8、9椎板至两侧关节突内缘。纵行剖开硬脊膜约0.5 cm，经硬脊膜切口，于硬脊膜下蛛网膜外，将超薄手术刀片抵在一侧骨壁上，划断脊髓，包括脊髓背静脉、两侧的脊髓背动脉和脊髓腹动脉，避免反复切割。选择健康足月产妇，待新生儿娩出后，按照Wang等［3］的方法备取第3代脐血干细胞，在立体定位仪下用1 μl微量注射器行细胞移植。D组大鼠采用毛细玻璃针行细胞移植，其硬脊膜切口采用显微缝合。其余各组大鼠背侧硬脊膜切口用胸背部筋膜片覆盖，常规分层缝合。术后连续3 d每日予青霉素（3万IU/kg）肌注1次。每笼饲养4～5只大鼠，恒温保暖，隔日更换垫料。每日行人工膀胱按摩排尿，早晚各1次。D组显微操作在10倍手术显微镜下完成。6 t+ V5 H0 {+ R' I- x+ C

1.4脊髓形态学观察及后肢运动功能评价　　术中观察各组大鼠脊髓形态结构变化。从术后第1周开始，对大鼠进行BBB评分［4］，每周1次，每次持续观察4 min或来回爬行5个轮回，取平均分，直至术后8周。没有额外的引诱或促动因素。评分者为非本组实验人员且熟知BBB 评分标准。术后第8周，过量麻醉处死大鼠，经心脏灌注固定脊髓，观察其形态、颜色、质地、体积大小及局部粘连情况，并与术中情况进行对比。$ t: T) [, _, r/ P( F

1.5统计学数据处理　　所有计量资料均以±s表示，应用SPSS 12.0软件包进行统计学处理，组间比较用OneWay ANOVA检验，组内比较用t检验。 P＜0.05为差异具有统计学意义。- T8 Q, |) L( Q- Z: z, a, z/ y
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2结果
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2.1人脐血干细胞分离、体外培养及免疫鉴定

　　共采集36份新鲜脐血，每份脐血平均采集量为25.94 ml(20～89 ml),脐血干细胞分离后，用苔盼蓝拒染法测定细胞活力。Olympus相差显微镜观察细胞并计数，可见少许死亡细胞呈深蓝色，绝大多数细胞拒染，呈明亮圆球状，活细胞百分比为（98%±0.71%）。细胞计数板计数，分离后每份脐血干细胞计数为（1.45±0.14）109/L。按Wang等［3］的方法体外纯化培养脐血干细胞，取第3代脐血干细胞，用流式细胞仪检测细胞表面抗原结果表明，人脐血干细胞不表达或弱表达CD34、CD45、CD106等造血干细胞和内皮细胞标志，但是显著高表达CD29、CD105等间充质干细胞表面抗原标志。

2.2大鼠术后情况及后肢运动功能评价, X+ Q" c# J6 }1 z) D" p

　　A组大鼠术后全部存活，术前、术后BBB评分无明显变化。B、C、D组大鼠术后均表现为双侧后肢完全性迟缓性瘫痪，B、C组大鼠分别死亡2、3例（均因术后尿道梗阻致膀胱破裂），D组死亡2例（其中1例为术后第9 d因大便梗阻致死；另1例为尿道寄生虫梗阻，膀胱破裂致死），B、C、D组死亡率分别为20％、15％、10%。并发单侧后肢褥疮3例（B组2例，D组1例），并发单侧下腹部褥疮2例（C、D组各1例），经积极创面护理后愈合。术后第2周，C、D组大鼠逐渐恢复部分后肢运动功能，D组大鼠后肢开始出现关节活动，并逐步出现下肢无承重划动、足背承重。从术后第3周开始，D组大鼠后肢运动功能恢复较快，BBB评分明显优于C组，开始出现后肢部分承重，并且后肢爪的功能出现不同程度的恢复，差异具有显著性意义（P＜0.05）。术后5～6周，C、D组大鼠后肢功能恢复进入平台期（表1）。表1术后各组大鼠后肢神经功能BBB评分结果比较 D组与C组比较，*P

2.3大鼠术中和术后第8周脊髓形态学观察
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　　A组大鼠硬脊膜完整，术中与术后相比脊髓未见明显变化，仅见硬脊膜与周围组织轻度粘连。D组采用显微操作，术中脊髓背静脉清晰可见（图1b），硬脊膜保存完好（图2c），行脊髓横断和脐血干细胞移植后两断端光整，外形饱满，术野清晰（图2d）；而B组和C组未采用显微操作，术中可见脊髓背静脉和硬脊膜毛细血管充血明显（图1a）。行脊髓横断后，B、C两组分别行PBS注射和脐血干细胞移植，术中可见横断处两侧脊髓部分塌陷、水肿、变形，脊髓残端参差不齐，部分大鼠可见脊髓组织水肿、膨出（图2a、2b）。术后第8周，所有实验大鼠脊髓横断处均瘢痕愈合，局部与周围组织粘连，以D组更为显著，分离困难；B组大鼠横断处远侧段脊髓明显萎缩、干瘪，直径变细（图3a）；C组大鼠横断处远侧段脊髓直径稍变细，但外形尚圆润、饱满(图3b)；D组横断处瘢痕增生范围最窄，两侧脊髓直径、外形、色泽无明显差异（图3c）。4 u5 C6 ^. L$ f  l: l9 R: [
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3讨论
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　　干细胞移植治疗脊髓损伤作为一种新的生物治疗手段，能够在一定程度上直接为病灶区补充神经元和神经间质细胞，促进残存神经细胞和轴突的存活与再生［5］，因而受到越来越多的关注。但是，目前已研究的干细胞，例如骨髓间充质干细胞、神经干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞等［5、6］，或因为取材来源受限，或存在伦理学等问题，使相关基础研究和临床应用受到限制。人脐血来源丰富，研究表明，在不同实验条件下，人脐血干细胞具有向包括神经细胞在内的各胚层细胞分化的潜能［1、2］，加之取材安全，操作简单，容易被孕妇及其家属所接受，无伦理学等问题，有望成为神经再生研究中移植干细胞的良好替代品［7、8］。作为中枢神经系统的常见病和多发病，脊髓损伤（SCI）的治疗目前仍限于保守支持治疗，虽然有应用干细胞治疗脊髓损伤的相关研究报道，但是效果尚不理想，其中存在的问题之一就是目前实验研究均未能有效突破神经再生的主要屏障—胶质瘢痕［9］。已有的SCI模型包括脊髓半切模型、全横断模型或脊髓打击模型等［10］，由于造模方法和操作的差异，难以对影响胶质瘢痕形成的原因、以及脊髓神经和轴突再生通过胶质瘢痕的能力进行量化评估，造成对治疗效果的评估困难。针对该问题，本实验对造模方法进行了一些改进：采用显微操作技术，在保证脊髓全横断的前提下，尽可能的减少操作中人为造成的对脊髓残端及残存神经纤维的损伤，从而尽可能的减轻神经胶质瘢痕的形成和缩小胶质瘢痕的厚度，为神经纤维和轴突再生通过胶质瘢痕区创造条件。8 R- b8 }% |9 O& P
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　　本实验组观察发现，在人脐血干细胞移植后的C、D组中，D组由于采用了显微操作技术，术中操作精细，对硬脊膜和脊髓的干扰和损伤少，术中脊髓背静脉清晰可见，结构清楚，硬脊膜保存完好；而未采用显微操作的C组，则可见脊髓背静脉和硬脊膜毛细血管网明显充血、扩张。同样，行脐血干细胞移植后，采用显微操作技术的D组脊髓两端齐整，横断间隙均匀，术野清晰，脊髓残端外形饱满、轮廓清楚；而C组脊髓残端则明显水肿、膨隆，部分横断间隙被膨出的脊髓组织所充填。在术后第8周，D组脊髓标本外形饱满，色泽乳白，直径均匀，横断处瘢痕组织增生非常局限；与此形成鲜明对照的是，C组脊髓标本可见长段瘢痕增生区，局部脊髓表面粗糙、外形粗细不均，而且远侧段脊髓直径也有所变细。由此可见，显微操作技术的应用，不但减少了操作过程中不可避免的对脊髓的人为损伤，而且减轻了胶质瘢痕的形成和胶质瘢痕的厚度。与此相一致，从术后第3周开始，虽然C、D组大鼠双侧后肢运动功能均逐步恢复，但是D组大鼠恢复的速度和程度明显优于C组，具有统计学意义（P

研究表明［7］，将人脐血干细胞植入大鼠脑内，移植细胞能够分化为神经胶质细胞和神经元。Willing等［8］将人脐血干细胞移植入成年大鼠局灶性脑缺血灶内24 h后，观察到成年大鼠记忆功能的改善。在本实验中，与采用人脐血干细胞移植治疗的C、D两组相比，虽然B组术中所见与脐血干细胞移植治疗的C组相似，但是，术后B组大鼠双侧后肢运动功能始终未见恢复，而且术后第8周，B组大鼠脊髓标本横断处两侧直径差异显著，远侧段脊髓明显萎缩、干瘪，直径变细，外形轮廓不规则。这表明，脐血干细胞移植对脊髓损伤有较好的治疗作用，但是其具体作用机制目前尚不完全清楚，有待进一步深入研究。- x; ]& P4 {* q! T1 X- Y' ^
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图1a普通操作致脊髓背静脉和硬脊膜毛细血管网明显充血、扩张图1b采用显微操作的D组，脊髓背静脉清晰可见，硬脊膜毛细血管无充血图2aB组大鼠脊髓横断 PBS残端注射后，横断处被水肿、膨出的残端脊髓组织充填图2bC组行脊髓横断脐血干细胞移植后，横断处两侧部分脊髓塌陷图2c、2dD组采用显微操作行脊髓横断脐血干细胞移植后，硬脊膜保存完好，脊髓残端整齐、结构清楚，横断间隙均匀图3术后第8周脊髓大体形态学比较

图3aB组大鼠脊髓横断处毁损严重，局部可见长段瘢痕组织增生，远侧段脊髓明显萎缩外形干瘪,直径变细图3bC组大鼠脊髓横断处亦可见长段瘢痕增生，远侧段脊髓直径稍变细，但外形饱满、圆润图3cD组大鼠脊髓横断处局限性瘢痕组织增生，横断处两侧脊髓直径，外形无明显差别
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综上所述，本实验成功建立了脊髓完全性横断大鼠模型，在脐血干细胞移植治疗脊髓损伤的同时，采用显微操作技术明显提高了受损脊髓的神经功能恢复。随着对脐血干细胞移植修复机制的深入研究和移植治疗方法的不断改进，相信显微操作技术必将在神经损伤性疾病的治疗中发挥更大的作用。1 _* y% O: C' ?2 P4 I& N4 T
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