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作者：姜振宇 许颖 姚程 宋晓燕作者单位：吉林大学第一医院血液科,吉林长春130021 5 X% |5 S" C3 P( D B8 S! R7 d7 ?
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【摘要】 目的 探讨体外2％氧条件下培养骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)培养液对成年大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成情况的影响。方法分离Wistar大鼠下肢骨获取MSCs进行培养，收集培养3、6、9、24 h培养液，用其刺激成年Wistar大鼠的心肌成纤维细胞30 h，采用MTT法和3H脯氨酸掺入法检测心肌成纤维细胞的增殖及胶原合成情况。结果 经3、6、9 h的MSCs条件培养液刺激后的心肌成纤维细胞3H脯氨酸掺入量与无血清对照组比较显著增加，分别增加23%(P＜001)、44%(P＜001)和31%(P＜001)，而24 h组与无血清对照组比较差异无显著性；MSCs条件培养液刺激后的心肌成纤维细胞MTT结果与对照组比较差异无显著性。结论 MSCs低氧条件培养液可以促进心肌成纤维细胞胶原合成，改善心功能。
- P1 O# g& T5 s7 W2 m" H 【关键词】骨髓间充质干细胞；心脏成纤维细胞;胶原( z( w) Y1 T/ P+ R* X& K
已证实干细胞心肌移植已成为心力衰竭治疗的新途径〔1，2〕。多数学者认为，骨髓间充质干细胞（MSCs）具有多向分化潜能,在一定条件下可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和心肌细胞等〔3～5〕。同时有学者研究发现，骨髓基质细胞可促进血管生成，并认为在血管生成的过程中，起关键作用的可能是干细胞分泌的细胞因子〔6〕。目前国内外对于MSCs移植心肌缺血区后其旁分泌途径的研究较少，本研究对此领域做一初步探讨,为临床应用提供理论依据和技术支持。1 z) Z/ W9 |' f$ k
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9 z, f Z g( r4 m 1 材料与方法
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11 试剂及仪器3 D" m' O; r( _; J/ r
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DMEM、新生小牛血清、胰蛋白酶(1∶250)购自hyclone公司；四氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；3H脯氨酸购自中国原子能研究院同位素研究所；CO2孵箱(为可调氧浓度的CO2孵箱)。$ a5 F. n* a) d& x' x7 G) V
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12 MSCs分离培养" t5 R0 z3 W) Q J+ m7 u5 l
: v7 o2 Y% ]9 f( b( Q7 ^雌雄不拘Wistar大鼠(80±5)g，麻醉、抗凝,无菌条件下剥离大鼠股骨和胫骨，经PBS漂洗用含15%血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，细胞悬液接种于培养瓶中置于37℃，5%CO2孵箱中培养。实验采用第2～5代细胞。5 k" J$ k. `, r+ e5 ?9 p& b" K* |& ]
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- @( }7 O. S" R$ u5 J0 ]! |13 心脏成纤维细胞分离培养
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& ^9 t) H- Z/ ^# y4 H, L雄性Wistar大鼠(200±10)g，麻醉、抗凝,无菌条件下手术开胸取心脏。经PBS冲洗后，分离去除心房和大血管，将心室剪碎，于恒温水浴振荡器中37℃振摇消化(150次/min)，消化液为含01%胰酶和01%胶原酶的DMEM)10 min，吸取收集消化所得的细胞悬液，剩余的组织块另加消化液再次消化，如此重复7次。收集第2～8次消化所得的细胞悬液至离心管，加入等量的含20%新生小牛血清的DMEM，离心(1 000r/min,10 min)、弃上清，加入含20%新生小牛血清的DMEM吹打成细胞悬液后过筛(360目)、再次离心、弃上清，加入含20%新生小牛血清DMEM吹打成悬液、接种至6孔培养板，于CO2孵箱中37℃、5% CO2 、95%湿度孵育30 min后PBS轻柔冲洗、换液，以后每2 d换液1次。常规培养、传代，取第2代细胞进行实验〔7，8〕。# [: A" r. V2 g! W: p
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3 Y _3 i- [: c4 \6 @; z' U14 SCs条件培养液的收集6 ?, v. u! |: _7 ^# \7 n
6 ^: s- N% U# j. X" H% W$ o培养第2～5代MSCs用PBS漂洗2次，去除残留的完全培养基，加入不含胎牛血清的DMEM培养液，然后将细胞置于可调氧浓度的培养箱，2%O2，无菌条件下收集3、6、9、24 h的培养液，置-70℃冻存备用。
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15 采用3H脯氨酸掺入试验测定心脏成纤维细胞胶原合成功能. R8 C* R: P- T, O
% n4 d' o3 ], C1 T+ {对数生长期心脏成纤维细胞接种在96孔板中，5103个细胞/孔，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养至细胞接近汇合。弃上清，加入含1%血清的DMEM继续培养24 h，使细胞进入生长静止期。分别加入MSCs条件培养液100 μl，3H脯氨酸925 MBq/L和维生素C 50 μg/L，共同孵育30 h。用008%胰蛋白酶溶液消化并收集细胞悬液，在022 μm的醋酸纤维素微孔滤膜上负压抽滤，生理盐水和10%的三氯乙酸冲洗滤膜，95%乙醇脱色，烘干后置入闪烁瓶中,加入PPO/POPOP/二甲苯闪烁液静置过夜后，在液体闪烁计数器上测定放射性强度。2 l, R# p1 M& L* `% b0 a8 U
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0 v. V1 z4 ?1 F2 G6 y: x* f0 c& q. N% b16 MTT试验7 t: ~6 s! K) O9 ^
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取对数生长期心脏成纤维细胞接种在96孔板中，5103个细胞/孔，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养，24 h后换无血清DMEM培养液，37℃继续孵育24 h，使细胞生长同步进入休止期。弃上清，分别加入MSCs条件培养液100 μl，继续培养30 h，各组于培养结束前4 h，每孔加入MTT(5 g/L)100 μl，37℃继续培养4 h后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，振荡10 min使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测定光吸收值(A490值)。
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17 统计学处理, X+ k( G, C7 t: j
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结果以x±s来表示，采用t检验。
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2 结果1 z/ M3 {3 }' q$ Y2 x& |6 Q
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21 MSCs条件培养液对心脏成纤维细胞胶原合成的影响
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成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞在经过MSCs条件培养液孵育30 h后，可见MSCs条件培养液可促进成纤维细胞的胶原合成(图1)。成纤维细胞，3、6、9 h组3H脯氨酸掺入量与无血清对照相比，分别增加了23%(P＜001)、44%(P＜001)和31％(P＜001)；24 h组3HPro掺入量与无血清对照组无显著差别。, F. i# X3 R$ t) G4 I$ `
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- }& K" e; [. S22 MSCs条件培养液对心肌成纤维细胞增殖的影响
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" a) c& r( u2 q' ?7 A成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞在经过MSCs条件培养液孵育30 h后，MSCs的条件培养液不能促进成纤维细胞的分裂增殖（图2）。成纤维细胞，3 h组、6 h组、9 h组和24 h组，各组间的OD490吸收值与对照组比较无显著性差异(P＞005)，说明MSCs的条件培养液不能促进心脏成纤维细胞的增殖。
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3 讨论
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{3 x7 Z4 d+ y, t 长期以来，心肌细胞被认为是不可能发生损伤修复的。但是,近年来随着干细胞移植的兴起,这一观念发生了改变，许多研究已证实心肌可通过多种途径发生再生和修复，缺血心肌的再生和修复已成为心血管病研究领域的一大热点。而MSCs是存在于骨髓基质中的一种非造血系干细胞，它不但能够在体外扩增，而且具有多向分化的潜能，可通过诱导分化为心肌细胞，促进血管新生等多种途径参与心肌的再生和修复。
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3 L: u9 E9 k+ N# c$ V% U c最近，Dai〔9〕等将MSCs移植到心梗大鼠的梗死区后，MSCs只存活了6个月。3个月后可在MSCs上检测部分肌细胞表型，而全部表型的出现则在6个月后，但心脏功能的改善却主要发生在4 w后，由此Dai推测MSCs的旁分泌在细胞移植治疗心肌梗死的过程中可能发挥了重要的作用。Kennard等〔6〕利用大鼠的后肢制作一缺血模型，然后将自体的MSCs注射入其缺血部位。发现移植的干细胞分泌的血管生成因子，促进大鼠后肢血管的再生并且改善了血供。" S4 B, f6 I0 ?/ K: a
! B |0 m, v" M 本实验在保证分组细胞生长状态基本一致的前提下，取对数生长期中后期的细胞，观察在缺氧不同时相干细胞条件培养液对心脏成纤维细胞3H脯氨酸掺入的变化,能较全面地考察缺氧对心脏成纤维细胞胶原合成的影响。结果发现成纤维细胞，3 h组、6 h组、9 h组3H脯氨酸掺入量与无血清对照相比，分别增加了23%、44%和31%。提示在心肌缺血区干细胞释放某些细胞因子，通过旁分泌途径促进心脏成纤维细胞合成胶原。而24 h组3H脯氨酸掺入量与无血清对照组无显著差别，这可能是由于随着缺氧时间的延长，干细胞分泌的细胞因子促进心脏成纤维细胞胶原合成能力弱于其胶原的分解能力，Frangogiannis等〔10〕报道，骨髓造血干细胞移植后，改善心功能的可能机制是合成基质金属蛋白酶及其抑制物，调节细胞外基质的代谢，改善心肌重构。MTT结果表明这种合成的增加并不是由于心肌成纤维细胞数目增多引起的，而是由于成纤维细胞本身胶原合成能力的增强而产生的。
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/ a' Z' H5 K8 v+ x' n 本实验的结果还显示，在缺氧3、6、9 h的干细胞条件培养液可刺激心脏成纤维细胞胶原合成增加，限制了心室特别是梗死区膨展；而在缺氧24 h的干细胞条件培养液与对照组比较胶原合成无显著变化，说明胶原的合成不再增加，抑制了心脏重构，使舒张和收缩功能改善。本实验在一定程度上解释干细胞移植后心肌功能改善的一些机制，并为临床提供技术支持。迄今为止,干细胞的研究刚刚起步，干细胞移植治疗心脏疾病的研究仍处于探索与试验阶段，远未达到临床应用的成熟地步。6 E. @4 q& @. V3 k( A$ S
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发表于 2009-3-3 12:29
发表于 2015-7-14 12:01
