骨髓间充质干细胞对持续缺氧心肌保护作用的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:28 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：曲环  郭艳红  朱小君  高炜  毛节明作者单位：(北京大学深圳医院心内科，广东  深圳  518036) : M9 ~5 H% t$ A/ ?7 D
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      【摘要】  目的  探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）保护持续缺氧心肌的作用及可能机制。方法  体外培养成年大鼠MSCs和乳鼠心肌细胞，在培养的乳鼠心肌细胞加入MSCs或其条件培养液，在无氧(95%N2 5%CO2)条件下共培养24、48和72 h，采用Hoechst33258染色细胞核，计算凋亡细胞百分率；采用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl2和Bax的变化。结果  缺氧可以诱导心肌细胞凋亡，培养24、48和72 h凋亡率分别为(26.5±6.1)%，(20.2±6.4)%和(51.6±2.4)%，与 MSCs共培养，心肌细胞凋亡率显著减低，分别为(7.3±4.7)%，(4.3±2.4)%和(15.1±5.4)%（P＜0.05）；与其条件培养液共培养24和48 h，心肌细胞凋亡率与对照组比较无明显降低，分别为(23.9±4.1)%和(20.7±2.5)%(P＞0.05)，共培养72 h，心肌细胞凋亡率为(24.2±4.2)%(P＜0.05)，显著低于对照组。蛋白质免疫印迹显示凋亡时心肌表达Bax水平较高，与MSCs或其条件培养液共培养72 h后，Bax表达水平呈不同程度降低，与心肌细胞凋亡发生率减低一致，Bcl2无明显变化。结论  MSCs在体外对持续缺氧心肌细胞具有一定程度的抗凋亡作用，其机制可能通过细胞间直接接触和旁分泌细胞因子，影响Bcl2家族部分蛋白在心肌细胞的表达。
      【关键词】骨髓间充质干细胞；心肌细胞；缺氧；凋亡8 B( O; R& c* Y+ _. n
   　　细胞凋亡是慢性缺血心肌中细胞丢失的主要原因之一，也是心脏功能衰竭的病理机制之一。抗细胞凋亡，抑制心肌重塑，已在近年成为心力衰竭生物治疗的又一个新方向。近年的研究发现骨髓间充质干细胞(MSCs)在一定条件下可以向心肌样细胞转化〔1,2〕，亦可通过分泌多种细胞因子，促进心脏血管生成，减少纤维斑痕形成和减少细胞凋亡〔3-6〕，但可能的作用机制尚未完全阐明。本研究观察了MSCs在体外持续缺氧条件下对心肌细胞凋亡的保护作用，并探讨了可能机制。! f, Z: s; A4 p3 B$ [, y0 S+ l

　　1材料与方法
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　　1.1实验动物成年雄性SD大鼠，体重为150 g左右，购自北京大学医学部动物中心。

　　1.2实验试剂胎牛血清（Hyclone）；Modified Dulbecco′s medium(DMEM)低糖培养基（Gibco）；DMEM高糖培养基（Gibco）；淋巴细胞分离液（上海）；Hoechst33258 (Sigma)；5溴脱氧尿嘧啶（Sigma）；Bcl2和Bax小鼠单克隆抗体（Santa Cruz）；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (北京中杉金桥公司)。' L0 L& l( C2 X
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　　1.3MSCs的分离、培养、鉴定无菌条件下取得骨髓细胞悬液，经密度梯度离心法获得单个核细胞层，含胎牛血清的DMEM低糖培养基贴壁培养传代，得到纯化的MSCs。取第4代细胞经体外诱导鉴定其多向分化功能后用于实验。- U' o2 e$ A3 C- T& i1 L9 b
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　　1.4心肌细胞的分离、培养无菌条件下取出出生24 h内的SD大鼠心脏，利用酶消化法和差速贴壁法得到原代心肌细胞，含胎牛血清的DMEM高糖培养基培养72 h，经鉴定后用于实验。, t& @3 B( u: B3 i  Q. @0 K* k

　　1.5MSCs条件培养基的制备取第4代MSCs，消化离心，用不含胎牛血清的低糖DMEM制成浓度为5103/ml的细胞液，接种贴壁后，置于无氧条件下培养24、48和72 h，分别收集上清液离心后用于实验。
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　　1.6细胞共培养的分组及处理将心肌细胞分为3组：A组为心肌细胞单独培养组，B组为心肌细胞 MSCs（心肌细胞∶MSCs=40∶1）组，C组为心肌细胞 MSCs条件培养液组，置于无氧条件下继续培养24、48和72 h，以制备持续缺氧模型。每组3个平行孔，重复3次。8 D5 V7 @$ L# w. {3 Y$ s* `
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　　1.7心肌细胞凋亡的检测将处理后的各组细胞弃去培养液，经甲醇/丙酮固定，Hoechst33258染色后，荧光显微镜下观察细胞核形态并计数，计算凋亡细胞占计数总细胞数的比例即凋亡百分率。每组3个平行孔，重复3次。( X4 R8 d4 }0 h+ k

　　1.8心肌细胞Bcl2/Bax蛋白表达的检测获得的各组细胞分别提取总蛋白，取适量（约20 μg）蛋白，98℃变性5 min，12%SDSPAGE分离，电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。含5%脱脂奶粉的Tris缓冲生理盐水(TBS/T)封闭1 h，加入一抗（1∶1 000）,4℃过夜，TBS/T洗3次，加入二抗（1∶2 000）孵育1 h，TBS/T洗3次，加入HRP 化学发光底物，压胶片曝光。应用Bandscan软件进行条带灰度分析。每组重复3次。
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　　1.9统计学分析数据以x±s表示，均数比较采用单因素方差分析，组间q检验。

　　2结果! B3 w- V# b" m1 s0 w

　　2.1MSCs对心肌细胞缺氧诱导凋亡的影响持续缺氧培养24、48和72 h，A组心肌细胞凋亡率分别为(26.5±6.1)%，(20.2±6.4)%和(51.6±2.4)%，与MSCs共培养(B组)，3个时间点心肌细胞凋亡率均显著减低，分别为(7.3±4.7)%，(4.3±2.4)%和(15.1±5.4)%，与A组比较有显著性差异（P＜0.05）；与其条件培养液(C组)共培养24和48 h，心肌细胞凋亡率与对照组比较无明显降低，分别为(23.9±4.1)%,(20.7±2.5)% (P＞0.05)，共培养72 h，心肌细胞凋亡率为(14.2±4.2)%，显著低于对照组（P＜0.05）。

　　2.2MSCs对心肌细胞Bcl2/Bax表达的影响在本实验的不同培养条件下，心肌细胞均表达Bcl2，A、B、C三组分别为6.41±0.29、6.28±0.27和6.57±0.26。各组间没有明显差异；而心肌细胞内Bax的表达随处理条件的不同发生变化。持续缺氧培养72 h，MSCs组和MSCs条件培养液组Bax/αactin灰度比值分别为2.28±0.46和3.01±0.26，与A组7.62±1.28相比，分别降低了70.1%和60.5%（P＜0.05），Bcl2/Bax比值分别增加2.3和1.5倍（图1）。
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　　图1心肌细胞在各种培养条件下的Western印迹结果（略）

　　3讨论( Q% I' A7 v, P) J

　　在心肌慢性缺氧时，可检测到心肌细胞凋亡事件的发生，它既是心肌细胞损伤的一种反应，同时又是心功能受损的一个重要参与因素。慢性心力衰竭时心肌压力负荷过重，细胞发生凋亡，引起细胞数目减少和心肌组织纤维化, 这些变化是导致心脏功能障碍的主要因素之一〔7〕。近年，人们已认识到减少心肌细胞凋亡，可能会减轻心脏病理性重构，减轻心肌纤维化，改善心脏功能。; c) B7 F+ S& H- q# B  j

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　　在新近研究中，人们发现骨髓干细胞移植能明显改善动物急/慢性缺血心脏的功能，在对MSCs心脏保护作用的进一步研究中发现：MSCs在梗死心脏微环境中可以向缺血梗死的心肌部位区迁移并向心肌样细胞和内皮细胞分化〔3,8-11〕，与宿主心肌细胞融合〔12-14〕，刺激新生血管生成〔3-5,15-17〕，减少心肌细胞凋亡和死亡〔6〕，减轻梗死缺血部位心肌纤维化〔18〕，改善心脏的功能。由于干细胞在体内向心肌样细胞的分化率以及与宿主心肌细胞的融合率很低，不足以补充损伤丢失的心肌细胞的数量，对心脏的保护作用很有限。因此，有学者认为干细胞移植可能主要通过旁分泌机制和加强对宿主存活心肌细胞的保护，减少因缺血而引起的心肌细胞凋亡和死亡，从而改善心脏功能〔6〕。在动物模型中已证实骨髓干细胞移植到急性梗死的心肌后，心肌细胞凋亡显著减少〔18，19〕。我们的研究也发现，在持续缺氧情况下，MSCs及其条件培养液均对缺氧诱导的心肌细胞凋亡有保护作用，而且MSCs组心肌细胞凋亡率低于其条件培养液组，提示MSCs在缺氧条件下，可能通过细胞直接接触和分泌相应的细胞因子等途径而起到抗凋亡作用，同时我们还发现当MSCs与心肌细胞在缺氧条件下共培养时，24 h已有保护作用，但MSCs条件培养液在缺氧条件下需要72 h才有保护作用，这也提示MSCs通过细胞直接接触很快起到抗心肌细胞凋亡的作用，而缺氧刺激MSCs分泌细胞因子可能需要一个过程，这只是我们的推测，尚需要进一步的研究证实。4 r. }0 i: x4 U& T/ ^/ V5 w

　　缺氧诱导的细胞凋亡主要通过线粒体途径进行调控，细胞外部因素可通过调节细胞内信号转导通路而发挥作用。Bcl2家族是调节细胞凋亡的重要分子, 通过自身或相互结成二聚体/多聚体的能力,以蛋白/蛋白的作用方式调控细胞的凋亡。Bcl2和Bax 属同源基因/蛋白,Bcl2 抑制细胞凋亡，而Bax 促进细胞凋亡。少量Bax 蛋白与低水平的Bcl2 蛋白即可形成Bcl2/Bax 异源二聚体,终止细胞凋亡的发生，若Bax 蛋白水平增高，则形成较多Bax同源二聚体,加速细胞凋亡的发生〔20〕。研究发现培养的新生鼠心肌细胞在慢性缺氧条件下，激活终末凋亡结构，包括细胞色素C释放，caspase效应器活化，而Bcl2表达降低〔21〕。在大鼠心肌缺血模型中，细胞凋亡增加的同时Bcl2蛋白表达减少，而Bax表达增加，提示这些蛋白在调节缺血诱导的心肌细胞凋亡中起作用〔22〕。本研究发现，在持续缺氧条件下，Bcl2的蛋白表达水平无明显变化，经与MSCs共培养，Bax的蛋白表达水平显著下降，Bcl2/Bax的比值增加，提示缺氧可能刺激MSCs分泌某些细胞活性因子，作用于心肌细胞，调节细胞内凋亡信号通路蛋白的含量，通过提高Bcl2/Bax比值，Bcl2/Bax结合增加，Bax/Bax结合减少，对心肌细胞的直接毒性作用减低，细胞线粒体介导的促凋亡作用减少，从而使心肌细胞的凋亡减少。* M6 m7 e$ `: a$ b  |
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　　MSCs对心肌损伤的保护作用机制是多环节的，减少存活心肌细胞凋亡可能具有重要的意义。我们的研究结果提示MSCs与心肌细胞共培养时，细胞间直接接触和干细胞的旁分泌机制可能同时起抗凋亡的作用；其作用机制之一可能是影响细胞凋亡途径中Bcl2/Bax的途径。然而细胞凋亡是受多种复杂因素调控的，MSCs对心肌细胞保护作用的机制，还有待于多方面的研究。. I# y! O8 r( g& r
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