神经干细胞移植治疗脑出血大鼠模型时间窗的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:27 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：罗文芳  黎杏群  罗杰坤  唐涛  林源  钟鹏程  刘清娥  易振佳作者单位：中南大学湘雅医院中西医结合研究所，湖南  长沙  410008
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      【摘要】  目的  研究神经干细胞移植治疗脑出血的时间窗。方法  分离、培养大鼠海马神经干细胞,经Nestin免疫荧光鉴定，Brdu标记；25只SD大鼠制作脑出血模型,随机分为5组（1、2、3、4 d移植组、模型组），分别在造模后第1、2、3、4 d移植Brdu标记的神经干细胞于脑出血大鼠的患侧侧腔室下区(SVZ)，模型组不移植,测试大鼠运动功能,14 d时处死,取全脑固定、冰冻切片、Brdu免疫荧光染色，Brdu阳性细胞计数。结果  各移植组大鼠神经功能缺损明显改善，2 d移植组明显优于其他组（P＜0.01）；2 d移植组Brdu阳性细胞数明显高于其它组（P＜0.05）。结论  神经干细胞移植治疗脑出血能有效改善脑出血动物运动功能；脑出血后2 d可能是神经干细胞移植的最佳时间点。
      【关键词】神经干细胞移植；脑出血；大鼠；时间窗
   基金项目：国家自然科学基金资助项目（30472264）
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　　Experimental study of neural stem cell transplantation for rat intracerebral hemorrhage in different time windows
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　　LUO Wen-Fang, LI Xing-Qun, LUO Jie-Kun,et al.
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　　Institute of Integrative Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan, China1 Q2 e- p0 B/ j+ P
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　　【Abstract】ObjectiveTo explore the best time of neural stem cells (NSCs) transplantation for intracerebral hemorrhage (ICH) in rats. MethodsRat NSCs were separated, cultured, identified by Nestin immunofluorescence and labeled with Brdu. 25 SD ICH model rats were randomly divided into 1, 2, 3, 4 d transplantation and model groups. Brdu labeling method was used to mark the transplanted NSCs in subventricular zone (SVZ) in the affected side of ICH rats 1, 2, 3, and 4 d after establishing model rats, except for model group. The motor function of the rats was tested. The rats were killed 14 later to obtain whole brain to prepare frozen section and to conduct Brdu staining to count Brdu positive cells. ResultsThe rats in transplantation groups had significantly better outcome than controls, especially for 2 d transplantation group (P＜0.01). The Brdu positive cells in 2 d transplantation group were significantly higher than those in the other groups (P＜0.05). ConclusionsNSCs transplantation for ICH could effectively improve the motor function of ICH animals, the 2nd day after ICH maybe the best time point for NSCs transplantation.

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　　【Key words】Neural stem cell transplantation; Intracerebral hemorrhage; Rats; Time windows
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　　脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)的发病率、病死率、致残率均很高，脑出血后最初30 d的死亡率是43%～51%，存活者75%留有不同程度残疾，如何能更好地使病人受损伤的各种神经功能得到改善,是一个世界性的难题。神经干细胞(NSCs)的发现为脑出血的治疗开辟了一条崭新的道路。研究发现，NSCs脑内移植后只有1%～3%细胞可以长期存活〔1〕，其可能原因是在一定时间窗内局部微环境不适合NSCs的存活，因此，选择最佳的时间窗以提高移植细胞在新的环境中存活率，对于研究NSCs移植治疗脑出血具有重要意义。本实验在大鼠脑出血后不同时间点(1、2、3、4 d)向其患侧侧脑室下区(SVZ)移植大鼠海马NSCs,观察大鼠的行为功能及移植细胞的存活、迁移，探索脑出血后NSCs移植治疗的时间窗。
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　　1材料与方法
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　　1.1材料

　　1.1.1实验动物清洁级健康SD大鼠25只，雌雄各半，鼠龄8～12 w，体重（220±20）g；清洁级初生3 d SD大鼠30只（中南大学实验动物学部提供）。
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　　1.1.2试剂Ⅶ胶原酶、Brdu（Sigma公司产品）；DMEM/F12、碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27(GIBCO公司产品)；小鼠抗Brdu单克隆抗体（Neomarker公司产品）；小鼠抗大鼠Nestin单克隆抗体（Chemicon公司产品）；浓缩DAB试剂盒、生物素化抗兔、抗小鼠二抗（北京中山生物技术有限公司）；胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所）；甲醇、H2O2、水合氯醛、二甲苯、无水乙醇、PBS等其他试剂(均为国产分析纯)。3 D, w1 J+ o4 V+ }) e) @7 i

　　1.1.3仪器Stoel TingTLO2 鼠脑定位仪（美国）；Leica1850 恒冷冰冻切片机（德国）；OLYMPUS IXTO倒置显微镜（日本）；GFL-3032型恒温水浴摇床（美国）；飞鸽牌微量进样器（上海）；CO2培养箱（USA）；Shandong 冰冻切片机（英国）。1 H3 Y3 Q0 S, B' P* W5 K; I7 s

　　1.2方法/ ~3 c5 j- f: Z3 O7 w5 A; p. x
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　　1.2.1分组用随机数字法将25只SD大鼠随机分成：1、2、3、4 d移植组、模型组，脑出血造模后分别在第1、2、3、4天进行NSCs移植，模型组不移植。
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　　1.2.2海马NSCs的分离、培养、传代与鉴定取新生（3 d）SD大鼠，断颈处死，以75%酒精浸泡5 min，无菌条件下取出大脑放入含无菌0.1 mol/L PBS培养皿中，剥除脑膜，分离出海马，按文献〔2〕方法取材进行原代培养：分离海马，去除脑室膜，机械分离组织成单细胞，以1105个/ml细胞种入培养瓶，培养基用DMEM/F12加B27、EGF(20 ng/m1)、bFGF(20 ng/m1)，常规CO2孵箱中培养。每3 d半量换液，待原代克隆形成后（约7～10 d），再次胰酶消化细胞克隆制成单细胞悬液进行传代；选取部分培养的细胞克隆进行Nestin免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞。
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　　1.2.3脑出血模型制作参照Rosenberg〔3〕等方法建立脑出血模型，用10%的水合氯醛（400 mg/kg体重）腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠于鼠脑立体定位仪上，切开头部正中皮肤，分离骨膜，暴露颅骨，根据鼠脑立体定位图谱确定进针部位：以前囟为原点，向后1.4 mm，矢状缝右侧旁开3.2 mm，定位于苍白球内，在颅骨表面开一个2 mm2 mm正方形骨窗，垂直向下进针5.6 mm，用微量注射器缓慢注入2 μl用无菌生理盐水稀释的Ⅶ胶原酶（含Ⅶ胶原酶0.4 U），留针5 min，然后退针0.5 mm，留针5 min后缓慢出针，缝合皮肤，络合碘消毒伤口。模型组用生理盐水代替Ⅶ胶原酶，余过程同前。, }9 y' W! a- w& z) \* I
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　　1.2.4体外培养NSCs Brdu 标记及 Brdu 免疫荧光细胞化学检测于移植前48 h，即最后一次传代后2～3 d，半量换液后2～3 h，将1 mmol/L Brdu储备液按1∶1 000稀释，使培养液终浓度为1 μmol/L，继续培养至移植。移植前将制备的单细胞悬液滴于明胶包被的载玻片上，在培养箱中4～6 h后，将载玻片放于4％的多聚甲醛中固定15 min，进行Brdu免疫荧光细胞化学检测。

　　1.2.5NSCs移植根据《大鼠脑立体定位图谱》定位〔4〕，选择前囟前1.60 mm，矢状缝向右1.20 mm，深4.00 mm为注射点，定位于前脑的SVZ。大鼠经腹腔以水合氯醛400 mg/kg麻醉，俯卧固定于鼠脑定位仪。按无菌操作规程，常规皮肤消毒，切开皮肤，以牙科钻开颅钻孔，以5 μl微量进样器注入5 μ l（1105个/m）细胞悬液，注射时间15 min，留针10 min后，退针0.4 mm，留针5 min以上，拔针，确定无颅内出血后，牙科泥封闭骨窗，缝合皮肤，局部络合碘消毒。+ j4 ]4 v6 S. [1 N  j3 K# u/ k; e
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　　1.2.6行为学测试采用爬行计分法〔5〕，将长2 m，宽2.5 cm的木杆，一端抬高45度，术前3 d训练大鼠由低向高处爬，直到熟练爬完全程。将木杆分为4段，每段6分，共24分，4段得分相加，即其最后得分。计分标准：6分，不能爬或滚落或趴于患侧；5分，患侧肢体拖行；4分，摔下或滑倒＞3次；3分，无滑落，但对侧后爪不触及木条侧面；2分，单侧跛行(肌力下降)；1分，四肢支撑变宽，位于木条下；0分，正常，无明显缺陷。在脑出血造模后的第1、2、4、10、14 d分别进行行为学测试，各组都于第14 d在行为测试后立即全部处死。
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　　1.2.7脑组织Brdu免疫荧光化学检测各组于第14 d进行行为学评分后，将大鼠用10 %水合氯醛腹腔注射深度麻醉，开胸直视下将灌注针（针头磨平）自心尖向右上45度进针至主动脉起始端，止血钳固定，剪破右心耳放血，快速灌200～250 ml生理盐水至眼球无色透亮后，滴注4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS（pH 7.2～7.4）200～250 ml，先快后慢，持续约40 min，可见大鼠肢体抽搐并逐渐变硬。断头取脑，放入4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS（pH 7.2～7.4）后固定2 h，移入30 %蔗糖-磷酸盐缓冲液中置4℃冰箱中过夜至沉底，入恒冷冰冻切片机，行30 μm 连续冠状面切片，收集血肿周围连续切片，裱于多聚赖氨酸处理载玻片上，风干，4℃保存备用，Brdu免疫荧光细胞化学染色。

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　　阴性对照用正常羊血清替代一抗孵育,其他步骤相同。结果判断以细胞呈棕黄色为阳性染色，所有阴性对照切片不着色,或仅呈淡的背景色。每张切片随机选取10个高倍视野（100）进行阳性细胞计数，计算10个视野平均阳性细胞数。

　　1.3统计学分析各组实验数据以x±s表示,应用SPSS13.0软件统计学分析，多组均数采用方差分析。3 Z# ]+ d# f8 A1 [6 ~) E
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　　2结果
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　　2.1海马成体NSCs的分离、培养与鉴定海马分离的细胞接种到无血清培养基，2 d后大部分（＞90%）细胞死亡，10%细胞贴壁，其中2%的细胞形成2～4个细胞团，10 d后长出大小不一、形态规则、呈悬浮状的细胞团即神经球，经免疫荧光化学检测为Nestin抗原阳性。细胞球经胰酶消化吹打制成单细胞悬液进行传代培养，2～4 d后单个细胞又可重新形成克隆球，并表达Nestin抗原。每次传代后，均有少量细胞贴壁分化，而且随传代的次数增多，贴壁的细胞也有增多的趋势，在7～8代左右还不影响细胞的传代，而后分化加剧，大部分贴壁分化。
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　　图1各组大鼠的行为学观察（略）) _; l3 o& w7 p% `
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　　图2不同时间点NSCs移植Brdu染色阳性细胞数比较（略）

　　2.2移植前后大鼠行为学变化大鼠脑出血造模后2 h左右清醒，24 h后观察其神经行为改变，模型组神经缺损症状轻微，各移植组和模型组大鼠均出现活动迟缓，易激惹，左侧肢体偏瘫，立行欲倒，侧旋转爬行或拖步行走，前爪抓力减弱等。各组大鼠爬行计分在2 d时达到最高，从4 d时开始逐渐下降；而脑出血10 d、14 d NSCs移植的4组大鼠与模型组比较差异有显著性(P＜0.01)，而2 d移植组疗效最佳，与1 d移植组、3 d移植组、4 d移植组比较有显著性差异(P＜0.01)。见图1。, E: M5 `4 s* M, R. X7 T
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　　2.3免疫组织化学染色Brdu染色阳性细胞为椭圆形棕黄色,移植后1 d、2 d、3 d、4 d移植组都可见阳性细胞,模型组没有发现Brdu阳性染色细胞,同时发现Brdu染色阳性细胞在2 d移植组最多,与1 d、3 d、4 d移植组比较有明显差异(P＜0.05)（见图2），且在脑出血血肿的周围部位也可以看到较多的Brdu染色阳性细胞,提示NSCs移植后能够发生一定的迁移。5 D8 a0 h7 T9 h6 W- y

　　3讨论( ?# P0 D0 ]' r7 B" H8 Z2 m
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　　3.1NSCs的分离与体外扩增干细胞的基本特性〔6〕：自我更新和分化潜能。就神经系统而言，必须能够分化产生神经元、星状胶质细胞、寡树突细胞以及产生一定数量的子细胞。本实验中从SD大鼠海马分离的细胞在细胞因子bFGF和EGF存在的条件下，通过连续传代能够产生大量与原代相似的子代细胞。经免疫细胞化学检测，几乎所有细胞团均为Nestin阳性细胞，Nestin 是神经上皮干细胞的特异性抗原〔7〕，在神经发生过程中一过性表达，被认为是NSCs的标志，说明该细胞群具有自我更新、增殖能力，体外分离、培养、扩增NSCs的成功为移植NSCs治疗脑出血提供充足的细胞来源。

　　3.2NSCs移植治疗脑出血1992年Reynolds和Weiss〔8〕首次从成年小鼠纹状体分离出NSCs以来,NSCs的研究越来越深入，其修复作用也在动物实验中得到肯定,并且证实移植的NSCs不仅可以迁移到损伤灶及其周围区域,并分化为神经垣和胶质细胞从而促进损伤灶的修复〔9〕。2003年Jeong等〔10〕用胶原酶注入大鼠脑内制作脑出血模型，将人胚胎源性NSCs经静脉注入模型，NSCs可迁移到血肿周围区，分化成神经元(10%)、星型胶质细胞(75%)，促进了脑出血后神经功能的恢复；Nonaka等〔11〕将胚胎干细胞源NSCs移入血肿对侧侧脑室，证实NSCs移植对恢复大鼠偏瘫肢体功能是有效的。同时国内也有研究表明移植神经干细胞治疗脑出血能明显改善实验动物的神经功能缺损，张朋奇等〔12〕用大鼠实验发现NSCs移植组和对照组在脑出血后一定时间内肢体运动功能均有所恢复，说明脑出血动物模型在脑损伤后部分神经功能可有代偿性恢复，与人类内囊区中等量出血性脑卒中的临床过程有类似之处。安沂华等〔13〕将大鼠胚胎NSCs移植血肿同侧尾状核较对侧有效改善运动神经功能。唐洲平等〔14〕用NSCs和溴鞘细胞联合移植于大鼠脑出血模型尾状核，可促进损伤组织修复和改善运动神经功能。薛村水等〔15〕将神经干细胞注入脑出血大鼠血肿同侧尾状核，显著改善动物的运动功能。本实验把体外分离、扩增的细胞用Brdu标记后定位注射于脑出血大鼠的SVZ区，脑出血大鼠的神经功能缺损得到明显修复,证实了NSCs的移植治疗作用。
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　　3.3NSCs移植治疗脑出血的时间窗脑出血后，机体和脑组织发生一系列病理生理变化，包括血肿扩大及占位效应、血凝块中凝血酶、血红蛋白及降解产物对脑组织的毒性作用及继发的脑水肿、局部脑血流量（rCBF）减少等变化，而且这种rCBF下降引起的缺血缺氧损害在血肿形成的早期即可出现，Kobri〔16〕在猫自体动脉血基底节出血模型研究中发现，血肿形成后5 min，两侧大脑半球的CBF明显下降；Yang〔17〕等也在同类实验中证实了脑出血后短暂性脑缺血的存在，脑出血后10 min，脑缺血区即开始增加，4 h后恢复到接近假手术组水平，而在48 h后，又出现显著的脑血流量减少。同时对于血肿的研究也发现脑出血第4天时血肿内见明显网状纤维网，7 d时血肿消失，形成胶质瘢痕〔18〕，这种脑内环境的变化可能也不利于移植细胞的存活。因此结合脑出血后的脑内微环境及组织的各项病理生理变化，推断脑出血后第2天进行NSCs移植可能是比较适合的时机。
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　　本研究发现大鼠脑出血后2 d移植的NSCs在大鼠脑内存活细胞数最高,与1 d移植组、3 d移植组、4 d移植组比较有显著性差异(P＜0.05)。其原因可能与上述的因素有关，各种兴奋性氨基酸、钙离子、氧自由基等的大量生成以及炎症细胞的局部浸润,都是移植细胞存活的不利因素,而脑出血后2 d内各种不利因素都处于高峰期,一直到2 d以后才逐渐恢复。因此,应避免在2 d内进行NSCs移植。在脑出血3 d进行NSCs移植,效果也不是非常理想,其原因可能是脑出血后2 d以后,各种神经营养因子分泌也逐渐下降,而神经营养因子对于NSCs的增殖、分化和迁移都起到重要的作用；而随着时间的延长，血肿区胶质瘢痕结构越来越紧密,不利于NSCs生长,同时也难参与神经修复。' O+ J4 _( }$ V8 V+ s* g
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　　总之，经NSCs移植治疗的脑出血大鼠,其脑出血后行为学改善较为明显,且不同移植组间有明显差异，大鼠NSCs在脑出血后2 d可能为最佳移植时间点,能有效提高移植NSCs的存活率。另外脑内移植细胞的存活还与移植细胞的选择、移植部位、损伤部位及有效的细胞用量〔19〕有密切关系,需进一步探讨。
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