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作者：李文娟，黄振平，李仲群，夏 元作者单位：（210002）中国江苏省南京市，南京大学医学院临床学院(南京军区南京总医院眼科) $ n( G" N- M" S: Q0 f$ _
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3 v) H2 E2 M0 @9 z3 L7 w7 b 【摘要】 目的：评价激光共焦显微镜在观察兔眼角膜缘干细胞缺乏后创面修复过程中的作用。方法：角膜缘干细胞缺乏家兔18只（雌雄不限）分A组为正常眼组，B组为角膜缘干细胞缺陷羊膜移植组。两组的家兔于术后第1，3，5，7，10，15，30d进行中央角膜各层组织激光共焦显微镜检查。结果：通过连续共聚焦扫描，获取手术前后角膜各层平面图像（x，y轴）及纵向断层图像（z轴），图像均非常清晰。角膜表皮细胞排列疏松,呈多角型,胞体发暗,边界清晰发亮，明亮的细胞核可见或不可见。术后30d后角膜上皮细胞排列整齐，光反射正常；前基质细胞边缘欠清，胞核明亮呈纺锤形。后基质角膜细胞核较长，相对前基质密度较低。术后30d基质细胞排列紊乱，散在的、反光较强的圆形物质，并产生反射较高的细胞外基质。一些细胞呈梭形，基质产生点状与线形交织的瘢痕组织；基质层内有少量的新生血管，见红细胞在血管内流动；内皮细胞呈规则的六边形,细胞边界呈黑色,胞体发亮,看不到细胞核，边缘发暗。术后角膜内皮细胞形态及数量无明显变化。1 s! ?3 ?& l2 E0 Z& K/ e9 B# j: `
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结论：激光共焦显微镜可对角膜进行无创伤、实时活体检查，具有高清晰度、确切的深度定位、时间动态观察、纵向断层扫描等优势，更可提供理想的角膜精确、可重复、深径度图像。 3 z: ?3 j; \; o
【关键词】干细胞缺乏；角膜；共焦显微镜；激光
- ^$ ?; a+ X. s" ^6 V) x 角膜上皮结构完整、功能正常对视力有重要影响。角膜上皮的完整性源于表浅层上皮细胞不断的脱落和死亡，角膜缘基底层的干细胞增生和分化取代脱落死亡的细胞。角膜缘干细胞作为角膜上皮细胞增生的贮备力量，位于角膜缘基底层。在维持角膜上皮细胞数目的平衡，保持角膜的透明性，创伤的愈合，抑制新生血管的生成等方面具有重要的作用。临床中经常可以见到一些与角膜缘干细胞缺乏相关的疾病,如酸碱化学烧伤、热烧伤、先天性无虹膜、Stevens Johnson综合征、瘢痕类天疱疮等自身免疫性疾病,严重的可导致眼表组织的广泛破坏,引起持续性角膜上皮缺损、慢性炎症、角膜混浊、新生血管侵入等一系列角膜损害,严重危及视力。以往对角膜病变的研究多为离体检查，激光共焦显微镜作为一种新型的光学显微镜，可在活体上对角膜进行观察。本实验利用兔眼角膜缘干细胞缺乏模型，观察角膜缘干细胞缺乏术后角膜损伤愈合的激光共焦显微镜改变。激光共焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统。通过激光共焦显微镜可以对样品进行断层扫描和成像。因此可以无损伤的观察和分析细胞的四维空间（三维空间和时间）结构。同时，通过激光共焦显微镜也是活细胞的动态观察、多冲免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
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1材料和方法, a! C$ i( O0 p+ k8 v( S1 o
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1.1材料 由南京军区总院动物房提供健康3～5mo龄新西兰大白兔18只36眼,体质量2.0～2.5kg,雌雄不限,检查无眼部疾患及全身器质性疾病。随机分为A组:正常无手术组9只18眼; B组:角膜缘干细胞缺陷羊膜治疗组9只18眼。术前给予氯胺酮50mg/kg,氟哌利多1mg/kg im全麻 ,术前4g/L盐酸奥布卡因(倍诺喜,日本参天制药株式会社)表面麻醉1～2次。术前剪去眼睑周围较长被毛,2.5g/L妥布霉素冲洗结膜囊。手术显微镜（蔡氏显微镜）,显微手术器械,羊膜，激光共焦显微镜(德国海德堡公司生产)，托百士滴眼液, 4g/L盐酸奥布卡因(倍诺喜,日本参天制药株式会社), 迪克罗眼凝胶(美国博士伦公司生产)。0 f: K0 L1 O+ I$ r3 D( z
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1.2 方法 常规消毒，表面麻醉，铺巾开睑，剪去第三眼睑，置上、下、内、外直肌牵引线，固定眼球，于显微镜手术条件下，用角膜剪沿角膜缘外2mm环形剪开球结膜，用隧道刀切除角膜缘浅层角膜及结膜上皮组织，宽约3mm，其中包括透明角膜区1mm，球结膜不缝合，刮除中央剩余的角膜上皮。术毕结膜囊内涂大量金霉素眼膏，并每日托百士滴眼液滴眼3～4次, 迪克罗眼凝胶涂眼1次。将羊膜从保存液体中取出，从硝酸纤维素薄膜上揭下，以4MU/L庆大霉素液冲洗，上皮面向上平铺于创面，9-0无创伤尼龙线原位间断缝合于巩膜浅层。剪去多余的羊膜，使羊膜的边缘位于球结膜边缘之下。术毕球结膜下注射地塞米松2mg，庆大霉素0.2MU/L。两组家兔于术后第1，3，5，7， 10，15，30d时用激光共焦显微镜观察对其上、下方角膜缘和角膜中央区及角膜上皮层、基质层及内皮层进行检查，各层角膜图像均被记录，观察组织结构和细胞形态。激光共焦显微镜(德国海德堡公司生产)是由海德堡视网膜激光断层扫描系统Ⅱ代(HRTⅡ)和Rostock角膜模块组件(RCM)组成。后者主要包括有:Rostock角膜显微适配器,CCD摄像头,Rostock角膜模块操作软件(包括自动图像分析和细胞计数)等。其中激光波长为670nm。观察视野为380μm380μm,放大倍数为800倍,分辨率为1μm。检查前给予氯胺酮50mg/kg,氟哌利多1mg/kg im全麻。受检眼用4g/L盐酸奥布卡因(倍诺喜,日本参天制药株式会社)表面麻醉1～2次,并滴用Vidisic眼凝胶(美国博士伦公司生产)。调整操纵台高度和CCD摄像头位置,滴1大滴Vidisic眼凝胶于物镜头表面,盖上一次性无菌的角膜接触帽。将做过手术的兔固定于操纵台前,下颌与前额分别固定在下颌托与前额托上,前移物镜至距角膜5～10mm处时,在CCD摄取的监控图像的指导下,上下左右调整物镜位置直至激光光束位于上方角膜缘中央,前移物镜至接触帽与之轻微接触,预设置两者接触的焦平面深度为0μm。转动焦平面调节环以获得角膜不同深度不同层次的图像。根据所获图像的真实焦平面位置(深度用μm数表示)进行调整。每一焦平面位置均可选择:(1)section模式:单张摄取图像;(2)sequence模式:连续摄取80张同一平面图像;(3)volume模式:连续摄取40张间距2μm的不同焦平面图像。完成检查移开物镜。检查另一受检眼前换用新的无菌角膜接触帽。检查结束后,选择有价值的图像与录像存盘[1]。
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2结果1 L& \3 @# a( f! b3 Y" Z
# A; c. O$ Y2 p M% m. M8 Y( I2.1外表及眼球表面 术后2～3d，术眼眼睑红肿轻，少量白色分泌物，术眼一般处于半睁状。移植的羊膜呈半透明状，表面光滑，结膜周围与羊膜贴覆好。术后1wk内逐渐变透明，结膜周围上皮在羊膜上呈向心性生长，同时亦伴随有较细小的新生血管向角膜长入经过17d（最短12d，最长30d）相继愈合。经过愈合的表面光滑、湿润、上皮层稳定。本实验结果显示：角膜缘干细胞移植治疗后，兔实验眼角膜上皮恢复完整性、新生血管减少、基质炎细胞浸润减少、透明性增加。3 R4 ^5 ]; s" @8 ?5 {; h
- }% j0 X x& Z; i5 H" z8 s( T T2.2上皮层 正常的表层上皮细胞有明亮的、中等亮度和暗的3种表现。表皮细胞排列疏松,呈多角型,胞体发暗,边界清晰发亮，明亮的细胞核可见或不可见。角膜中央上皮基底细胞排列紧密,呈鱼卵状，胞体圆形，边界明亮,胞质和细胞核反光较明，大小一致。术后1mo后角膜上皮细胞排列整齐，光反射正常（图1A）。
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& \4 {7 v; W8 w: X2.3基质层 基质层中,可看到在相对较暗的背景下明亮的角膜细胞核,被一些无一定形光反射状的背景物质分隔开,不能观察到胞质、细胞边界和胶原层。前基质细胞边缘欠清，胞核明亮呈纺锤形（图1B）；后基质角膜细胞核较长，相对前基质密度较低（图1C）；术后1mo基质细胞排列紊乱，散在的、反光较强的圆形物质，并产生反射较高的细胞外基质（图1D）。一些细胞呈梭形，基质产生点状与线形交织的瘢痕组织；基质层内有少量的新生血管，见红细胞在血管内流动（图1E）。
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1 p4 x( V5 G; [4 a2.4内皮层 内皮细胞呈规则的六边形(图1F),细胞边界呈黑色,胞体发亮,看不到细胞核，边缘发暗。与角膜内皮镜检查时的细胞形态相同,细胞密度越大者,六边形形态规则占的比例越大;反之, 细胞六边形越少,不规则形细胞比例增大。术后角膜内皮细胞形态及数量无明显变化。$ I* ?, D5 J" P. b" f# A# }* e! h
$ a) n- ~: m5 T图1 免眼角膜缘干细胞缺乏羊膜移植后形态(LCM) A:术后1mo后角膜上皮细胞排列整齐，光反射正常；B:基质细胞边缘欠清，胞核明亮呈纺锤形；C:后基质角膜细胞核较长，相对前基质密度较低；D:术后1mo基质细胞排列紊乱，散在反光较强的圆形物质，并产生反射较高的细胞外基质；E:基质层内有少量的新生血管，见红细胞在血管内流动；F:内皮细胞呈规则的六边形，胞体发亮，边缘发暗
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3讨论4 Z7 G& U* G* u- B7 i) U/ b
8 ]0 I& G# k9 O+ H7 F3 z( b+ J引起角膜缘干细胞的缺陷有原发性和获得性原因。先天性无虹膜是一种遗传病，可能缺乏基质的支持而导致原发性干细胞的功能不全。更常见的干细胞缺陷是由获得性因素引起的，例如：化学伤或热烧伤、接触镜所致的角膜病、慢性角膜炎、角膜缘手术创伤、Stevens－Johnson综合征等。以上各种病因引起患者畏光、疼痛、角膜结膜上皮化、视力下降，甚至失明。本研究利用兔眼角膜缘干细胞缺乏制作临床常见的角膜干细胞缺陷模型，使用先进的海德堡视网膜断层扫描系统Ⅱ代(激光共焦显微镜)观察其羊膜移植后的表现。正常组激光共焦显微镜检查结果：角膜表皮细胞排列疏松,呈多角型,胞体发暗,边界清晰发亮，明亮的细胞核可见或不可见；前基质细胞边缘欠清，胞核明亮呈纺锤形；后基质角膜细胞核较长，相对前基质密度较低；内皮细胞呈规则的六边形,细胞边界呈黑色,胞体发亮,看不到细胞核，边缘发暗。角膜缘干细胞缺陷羊膜移植1mo后激光共焦显微镜检查结果：角膜上皮细胞排列整齐，光反射正常；基质细胞排列紊乱，散在的、反光较强的圆形物质，并产生反射较高的细胞外基质；一些细胞呈梭形，基质产生点状与线形交织的瘢痕组织；基质层内有少量的新生血管，见红细胞在血管内流动；角膜内皮细胞形态及数量无明显变化。本研究结果显示：角膜缘干细胞缺陷羊膜移植后，兔实验眼角膜上皮恢复完整性、新生血管减少、基质炎细胞浸润减少、透明性增加。
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! l5 p" Z( B( q9 M* Q7 I6 m0 F海德堡视网膜断层扫描系统Ⅱ代(HRTⅡ)是利用共聚焦激光的原理获取和定量分析眼后节三维形态的仪器,通过增加Rostock角膜模块组件(RCM),可转变成激光共焦角膜显微镜。HRTⅡ/RCM内部含有一个波长670nm的二极管激光源[1]。激光束聚焦在角膜,焦平面通过振荡镜周期性的移动,从而连续扫描获得角膜各层二维图像。光敏探测器可以测到每一点的光反射强度,仅有焦平面上的反射光及其周围的散射光可被探测器接收,而焦平面以外的反射光、散射光均被高度抑制,所以生成的二维图像是角膜上共焦平面所在位置的平面图像。共焦平面可以通过焦平面调解环进行手动调解,因此可获得角膜各个层面的图像,一系列不同共焦平面的图像组成了三维图像,真实的焦平面位置与获取的图像是同时储存的[2]。与传统的光学共焦显微镜相比,激光共焦显微镜具有许多优势:（1）由于激光特有的单色性和相干性[3],使图像清晰,分辨率高至1μm,极大提高了对角膜尤其是角膜缘疾病的诊断和基础研究的水平。（2）可以对病变进行确切的深度定位,可重复性好,有利于病变的前后对比。（3）独特的纵向断层扫描实现了对角膜病变的多层次立体观察,达到了类似组织切片的效果。（4）提供多种图像获取模式,不仅可对同一焦平面进行动态连续扫描,而且可对某一焦平面Z轴向后60μm深度进行动态连续扫描,实现了时间与空间的动态观察。（5）提供摄像头实时监测受检眼角膜位置,使检查更有效省时,大大减少了对患者角膜损伤的可能性。（6)可测量角膜各层次厚度。所以激光共焦显微镜为眼科医生提供了非常细致有效的角膜活体组织学检查,尤其使活体观察角膜缘结构成为可能。 用激光共焦显微镜获取的角膜中央各层次的图像均较传统的光学共焦显微镜在清晰度上有很大提高[4,5],另外,纵向断层扫描可同时获得2～3层的角膜细胞图像,达到类似组织切片的效果。
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; k1 p* v) m4 m8 ?4 @( H3 X共焦显微镜的镜头是通过特制眼用胶接触受检查的角膜,因此对受检者无明显不适,易于被受检者接受,且是无创性的方法。本研究中利用激光共焦显微镜显示的角膜层间及基质及内皮数更为清晰,更有利于对病变的观察分析。在实践中也发现对眼窝深、睑裂小、配合不良的患者,应用激光共焦显微镜检查有一定困难。在检查中我们使用钢丝开睑器开睑,完全避免了眼睑运动所致的图像欠清晰的缺点。
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综上所述,我们首次应用激光共焦显微镜对兔眼角膜缘干细胞完全缺乏动物进行了观察,图像清晰,结果理想,可获得裂隙灯显微镜和传统光学共焦显微镜所无法获取的图像和效果。我们首次用共焦显微镜检查角膜各层细胞的变化,取得较好的结果。提示共焦显微镜是目前研究角膜的活体细胞变化及临床角膜病诊断的一种有用的工具。对屈光性角膜手术后的观察、角膜缘和角膜移植术后的观察、角膜感染的无创快速诊断、配戴角膜接触镜后的角膜状态随访等有着广阔的应用前景。5 P, q1 p% P8 l/ i: W. T9 ?% g
【参考文献】
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0 a: x5 F/ t: z N; v( M y 2荣蓓,晏晓明.激光共焦显微镜对正常人眼角膜缘和中央角膜的观察.中华眼科杂志,2006;42(1):17-21# m" I' E) {) d7 v y& Z
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发表于 2009-3-3 12:27
发表于 2013-3-13 09:51
