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作者：李敬来 许志锋作者单位：北京大学深圳医院心血管外科， 广东 深圳 518036
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【摘要】 目的 观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）转染自体骨骼肌干细胞缺血心肌内移植对心肌结构及骨骼肌卫星细胞转归的影响。 方法 取大白兔大腿肌，分离卫星细胞后培养、转染并用4’,6-二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI）标记。建立急性心肌梗死动物模型。将bFGF转染的卫星细胞注射在梗死灶周边心外膜下。4周后取出心脏，对缺血心肌结构及卫星细胞转归情况进行观察。 结果 移植的卫星细胞分化成为带有横纹的心肌样细胞；在卫星细胞移植区心肌细胞玻璃样变性较轻，肌纤维排列有序，微血管生长良好。 结论 bFGF转染自体骨骼肌卫星细胞在缺血心肌中可分化成心肌细胞样细胞，局部血液循环得到改善。 " C2 f6 f U4 |* W. k1 K
【关键词】干细胞 bFGF 移植 心肌梗塞 大白兔
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" p6 F N! H( J: N o" x3 ?- j3 N- h) oThe effection of transfected skeletal muscle stem cell with bFGF to ischemic myocardial structure in rabbit model2 c4 {# k& v; {$ I( n P
1 m& k- u8 ]$ z7 d8 N6 ULI Jing-lai, XU Zhi-feng. Department of Cardiovascular Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China
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[Abstract］ObjectiveToobserve the influence of transfected autologous skeletal muscle stem cell with bFGF to rabbit ischemic myocardial structure. MethodsSatellite cells isolated from rabbit skeletal muscle, cultured, transfected with bFGF and labeled by 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), then injected into ischemic myocardium surrounding. The specimens were harvested 4 weeks letter. Histologic sections were examined under common light microscope and fluorescent microscope. Results The progressive differentiation of implanted satellite cells into fully developed striated muscle fibers could be observed. The fibroatrophy of the host ischemic myocardium had been effectively inhibited, muscle fibers arranged in an orderly manner and microvascular growth well. ConclusionTransfected autologous skeletal muscle stem cell with bFGF implanted into the ischemic myocardium of rabbit can differentiate from cardiomyocyte-like cells. The local blood circulation is improved.
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[Key words］stem cells; bFGF; transplantation; myocardial infarction; rabbit: ]8 a' ?0 p# d* b, p7 U3 |
0 y1 o: p8 U% u* m20世纪70年代末，Bader等证实受损的蝾螈心脏可以由绞碎的心肌碎片成功修补以来，细胞移植治疗心脏疾病的研究备受重视。然而，梗死心肌局部缺乏血供，单纯细胞移植将很难存活。本实验利用bFGF转染骨骼肌卫星细胞，然后再进行心肌内移植，试图造就一个有氧环境，以有利于移植细胞的成活。4 l" ~& ]9 z* j5 d. ?; Z
% |; }: N' x F1 材料与方法; R2 h( |* c# h& h g/ }8 ~
1 e+ g$ b; M* ^5 _3 n1.1动物模型 新西兰大白兔18只，雄性，体重2kg左右。共分3组：空白对照组（6只），细胞移植组（6只），bFGF转染细胞移植组（6只）。3％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉。连续监测心电图。胸部正中切口，沿胸骨左缘剪断第3、4 肋软骨，暴露心脏，在左室支与左心耳下缘交点下5～10mm用4-0线结扎左室支。观察心电图，出现ST段和(或) T波抬高或降低，心肌收缩力下降，心脏局部颜色变暗等变化作为成功标志。
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1.2骨骼肌卫星细胞的分离培养 戊巴比妥钠30mg/kg麻醉。取大腿肌组织3～5g，制备骨骼肌细胞悬液。用含二氧化硅凝胶的细胞分离液（Percoll）分离纯化卫星细胞[1]。细胞计数，台盼蓝鉴定活性。
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1.3卫星细胞的培养、传代、鉴定和转染 将卫星细胞悬液放在25cm2培养瓶中。用生长培养基（DMEM培养液 20%胎牛血清，谷氨酰胺72mg/L，青霉素、链霉素各100u/L）培养。取培养至第2～3代的细胞，用骨骼肌肌球蛋白快收缩肌纤维抗体（skeletal myosin II）进行鉴定。利用带绿色荧光蛋白（P-EGFP）质粒估测转染效率。利用Lipofectamine 2000将含bFGF基因的表达脂粒转染到骨骼肌卫星细胞内。
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1.4骨骼肌卫星细胞标记及移植 用DAPI对骨骼肌干细胞进行标记，计数（数目应可达１106个），台盼蓝测定活性。取106个细胞，加入DMEM液200μl。在心脏结扎点以下左室颜色改变、搏动减弱区边缘用4.5号针心外膜下共注射4个点各50μl，每点间距0.5cm。对照组注射DMEM各点均50μl。
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1.5组织学检查及细胞计数 于细胞移植4周后，取出心脏标本，制备冰冻切片，进行观察。每只兔取 4个注射区切片各2张，切片在400倍显微镜下随机取5个视野计算DAPI阳性染色细胞数，取平均值作为该兔骨骼肌卫星细胞数目。
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4 L( @) O* i* Y( w' Z1.6表面抗原检测 利用免疫组化方法检测缝隙连接蛋白（Connexin-43）及骨骼肌肌球蛋白快纤维型的表达情况。利用CD34进行局部微血管情况检测。每只兔取4个注射区切片各2张，每张切片在400倍显微镜下计算视野内的阳性染色细胞数作为血管数，取其平均值作为该兔血管数目。: d: y c( ], V3 q
( y( w( t/ g' W: t' i2结果
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8 Y u& p ?* P( {2.1动物模型 本实验建立模型18例，均获成功。不用呼吸机，方法简单，成功率高。0 N/ i3 u6 r% l j& R
, f" U9 j: I0 l7 i0 y2.2卫星细胞的数量 可获得1106个卫星细胞左右。台盼蓝鉴定卫星细胞活性为80%～85%。刚分离的卫星细胞呈小圆形，折光性强，2～3天后细胞呈针状，3～4天形成细胞克隆。& w3 P6 c! A5 f
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2.3卫星细胞存活情况 卫星细胞移植4周后，空白组未见黄绿色荧光。细胞移植组及转染细胞组缺血心肌的中均可见到有卫星细胞分化而来的横纹肌细胞，其中转染组切片中可看到大量发出黄绿色荧光的心肌细胞样细胞。
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2 y7 R" x |% w, Q" i3 X2 U2.4移植细胞表面抗原表达情况 空白组看不到缝隙连接蛋白（Connexin-43）及骨骼肌肌球蛋白快纤维型表达，检测不到CD34，说明局部没有微血管生长。细胞移植组及转染细胞移植组缝隙连接蛋白（Connexin-43）均为阴性。骨骼肌肌球蛋白快纤维型均为阳性。细胞移植组及转染细胞移植组CD34均有表达，尤以转染细胞组为多。8 D+ l* J% u5 v2 R f) m p" L
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2.５心肌病理改变 卫星细胞移植4周后，空白组梗死面积较大，心肌形成的瘢痕远较二实验组大，病理切片上可见到透壁均质纤维结缔组织，心肌纤维排列紊乱，未发现有微血管生成。细胞移植组及转染细胞移植组，梗死面积较小，心肌纤维排列较空白组整齐，可见到许多由卫星细胞分化而来的横纹肌纤维，有的肌纤维间已经形成连接，转染细胞组可见有大量的微血管形成。4 t% X; \7 [! y) x2 \# n0 R
7 ?) }* B. C3 ~7 k3讨论$ L+ S0 C1 [$ q8 p# b3 l
% _% b5 ~/ L4 }; N骨骼肌卫星细胞是未分化细胞[2]，有巨大的再生潜能。在适当条件下, 卫星细胞可在受损部位进入增殖周期，相互之间及与原有心肌细胞之间形成连接[3]，分泌结构蛋白及收缩蛋白，修复损伤组织[4]。' b6 H2 I# i- B0 b( [6 O
" o8 C$ e$ k. D& i成纤维细胞生长因子(fifroblast growth factor，FGF)是一类具有较高活性的多聚肽[5]，现已发现其家族有int-2、FGF-5、KGF-7等9个成员。其中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种广谱的有丝分裂和毛细血管增殖刺激剂，对来源于中胚层和神经外胚层的细胞如成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞等有明显的促增殖作用。缝隙连接蛋白43（Connexin-43）是缝隙连接的一个主要蛋白，主要表达在心肌细胞上。骨骼肌肌球蛋白快纤维型只表达在骨骼肌细胞[6]，是骨骼肌细胞特异性抗原，心肌细胞和平滑肌细胞均不表达。CD34是新生血管内皮、骨髓干细胞上表达，常用来进行微血管的检测，特异性较高。
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# q8 C( I( K& h本研究显示，在空白对照组，空白组看不到缝隙连接蛋白（Connexin-43）及骨骼肌肌球蛋白快纤维型的表达，说明没有成活的心肌细胞及骨骼肌细胞。CD34不能检测到，说明局部没有微血管生长。细胞移植组及转染细胞移植组缝隙连接蛋白（Connexin-43）均为阴性，说明移植的骨骼肌卫星细胞并不能完全分化成具有缝隙连接的心肌细胞，而只能分化成心肌样细胞。细胞移植组及转染细胞移植组骨骼肌肌球蛋白快纤维型均为阳性，说明这些移植细胞仍具有向骨骼肌细胞分化的倾向。细胞移植组及转染细胞移植组CD34均有表达，尤以转染细胞组为多，说明bFGF具有刺激新生微血管形成的作用。
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: z6 R' |2 v: m+ M" x4 v病理发现，空白组梗死面积较大，心肌形成的瘢痕远较二实验组大，心肌纤维排列紊乱，未发现有微血管生成。细胞移植组及转染细胞移植组，梗死面积较小，心肌纤维排列较空白组整齐，可见到许多由卫星细胞分化而来的横纹肌纤维，有的肌纤维间已经形成连接，转染细胞组可见有大量的微血管形成，进一步说明说明bFGF具有刺激新生微血管形成的作用。
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总之，bFGF转染骨骼肌卫星细胞进行梗死心肌内移植，可以有效减小梗死面积，抑制心肌纤维重构，促进移植细胞存活和分化，促进微血管的生成，改善局部血供，从而有效改善心脏功能。因此，bFGF转染骨骼肌卫星细胞进行梗死心肌内移植，可能将成为治疗心肌梗死的有效方法。
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【参考文献】+ w" B5 }1 z0 @# b% O4 W
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