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骨髓间充质干细胞促进骨-肌腱结合部愈合的初步观察

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发表于 2009-3-3 12:26 |显示全部帖子
作者:董飞 陈鸿辉作者单位:暨南大学医学院第四附属医院 广州市创伤外科研究所,广州  510220 5 h( K, y  c9 j/ }0 Q
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. {, U. \: }8 C0 x% r9 F                         1 R4 L) g: L- L' H6 r" }4 c' \' m
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9 V1 S- W9 O* |" T* |& I          【摘要】  观察骨髓间充质干细胞对骨-肌腱结合部愈合的影响。[方法]采用骨髓穿刺、全骨髓培养法获取兔骨髓间充质干细胞。36只18周龄新西兰大白兔随机分为2组,实验组将骨髓间充质干细胞与Pluronic F-127载体材料结合后,植入兔髌骨部分切除模型,对照组只进行手术,不植入细胞。在术后6、12、18周进行X线片、大体和组织学观察评估。[结果]X线片显示术后6、12、18周实验组骨-肌腱结合部新生骨面积显著大于对照组(P) ^( T! ^; u5 y
          【关键词】骨髓间充质干细胞 骨-肌腱结合部 愈合
* A2 x& P# x7 T+ @                    Primary observation on bone mesenchymal stem cells accelerating bonetendon junction healing∥DONG Fei,CHEN Honghui,YANG Xiaohong,et al.Guangzhou Research Institute of Traumatic Surgery, The 4th Affiliated Hospital, Jinan University,Guangzhou 510220,China' c1 i: ]! K3 l# v+ \. O, W
% o5 g" z; M# C; j
Abstract:[Objective]To evaluate tho effects of Bone Mesenchymal Stem Cells(BMSCs) on healing of bonetendon junction in a patellar tendon complex.[Method]The BMSCs of rabbits were harvested by bone marrow aspiration. Adherent cells were selected as BMSCs after the whole marrow was cultured.Standard partial patellectomy was conducted in 36 18weekold rabbits divided into 2 groups. The experimental group was planted into by the composite of BMSCs and Pluronic F127 while the control group was only operated without BMSCs planting into.The patellarpatellar tendon complexes were harvested at weeks 6,12,18 postoperatively for radiographic, gross and histological evaluations.[Result]Radiographic measurements showed significantly more newly formed bone at the patellar tendonpatellar healing junction in the experimental group compared with that of the controls at weeks 6,12,18(P
+ X4 h7 |; z) l) H
7 ^5 J5 e: b# Y( ^! q0 H7 R1 `- aKey words:bone mesenchymal stem cells;bonetendon junction;healing
; e( l, t3 r* _, O
% ^$ D# u8 |: q, l+ }9 `2 P多种原因导致的肌腱止点的损伤,如肩袖损伤、网球肘、部分撕脱型跟腱断裂等发病率逐年增高。骨-肌腱结合部愈合过程比较复杂,该部位的特征性结构纤维软骨带的再生十分缓慢和困难[1]。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是多种间充质细胞的前体细胞,有多向分化潜能,传代繁殖能力强,生物相容性好等优点。本研究将骨髓间充质干细胞移植入兔髌骨部分切除模型中[2],通过X线片、大体和组织学研究,观察其在骨-肌腱结合部修复中的作用。3 y5 R. |( I% L+ ~1 r8 S- s
9 s) y" O; ^4 d. ^2 B
1材料与方法
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1.1兔BMSCs体外分离,培养与扩增1 s3 g4 c' n1 V5 W3 T+ P5 v* c3 B/ |
& k( a' W: X0 s5 h
8周龄新西兰大白兔,无菌条件下抽取股骨干骺端骨髓3 ml,100目钢网过滤,1 200 r/min离心10 min,采用全骨髓培养法以(6~8)104/cm2置于75 ml培养瓶培养,每瓶含10 ml培养液(含青、链霉素各100 U/ml,体积分数为20%胎牛血清,αMEM),37℃、5%CO2孵箱中原代培养。4 d后半量换液,以后每48~72 h全量换液。当细胞融合达80%时,0.25%胰蛋白酶消化,以5104/cm2接种到培养瓶传代,收集第3代细胞供移植用。
/ k5 g& y" ?# f) Q/ B$ m  S, S5 I5 u. }( n' ]! k, f8 I6 a
1.2BMSCs移植修复骨-肌腱结合部(bonetendon junction,BTJ)损伤
/ @4 b: s. J4 {$ f# D1 y/ W" h9 x$ T; n. S9 I) e
1.2.1实验动物及分组36只18周龄新西兰大白兔,体重2.2~2.5 kg,随机分为实验组(BMSCs 载体Pluronic F-127)和对照组(只手术,不植入BMSCs和载体),分6、12、18周3个时间点,每个时间点6只。
- _1 j) T6 v4 v* G7 a3 n4 p# ~6 r( ]8 H# i5 c, ?  B
1.2.2兔髌骨部分切除手术[2]麻醉下左下肢膝外侧入路,于髌骨远端1/3横行截骨,去除远端1/3髌骨,垂直近侧剩余髌骨钻2个0.8 mm的孔。髌韧带用不可吸收缝线缝合于近端髌骨上,实验组将BMSCs 载体复合物植入髌骨与髌腱之间,8字钢丝保护,膝关节石膏固定于屈膝90°位。6周后拆除石膏,笼内自由活动。在术后6、12、18周取材,分别作大体解剖检查,X线片分析及组织学观察。
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( b0 ]2 B2 Z3 S) f8 O0 L1.3X线片观察# M7 V, G! U' }7 \+ O! k) t

* a2 |  Q# Y' L$ B1 I在标本X线正位片中找出手术截骨线,观察从近端残余髌骨长出的新骨,由同一个检测者用Image J图像分析软件分析测量,得出新骨面积定量数值。; X% ^% @1 Q2 c2 ]' S3 i) A
8 C& v: [5 u( X
1.4资料的处理和分析方法
, @0 _  l2 D  H. y1 U: d6 P
% [* C- s" F# n( U; {X线片用SPSS11.5统计软件处理,双因素方差分析,对实验组、对照组的差异性进行统计学分析,P≤0.05(双尾)为差异具有统计学意义。
- T& e8 b3 e2 D4 q+ S1 Z" z+ D0 P- b% M2 v- x8 {5 E" S' h! B
2结果
4 x! B7 S& U/ H$ Y( ^9 K4 ]) }+ Q4 d5 A6 N  @: d& z( n' P
2.1BMSCs培养情况1 W5 o8 H( [+ x4 z& J0 D  j
- c/ v2 |7 L3 M  s0 d; b
原代培养第6 d首次全量换液后,倒置显微镜下观察可见培养瓶中有许多增殖中的细胞克隆形成,克隆大小不一,最大可占据整个100倍视野,克隆中心向周围有放射状生长的贴壁细胞,形态多呈多角性、短梭形。随着换液,非贴壁细胞逐渐被弃掉。8~10 d后,各个集落之间基本融合达80%,予以传代,传代细胞呈长梭形,细胞生长密集时,其形态通常呈均匀一致的成纤维细胞样。
* V% E+ p$ B! p$ [# k9 v: Z6 K1 M! ?1 J) [1 S
2.2X线片! F/ A/ u3 Q. q" _) N& C
" e# _  ]9 b. T$ Q  X( y# P0 H
X线片经Image J软件处理,结果显示实验组6、12、18周的新生骨面积均明显增大(图1),与对照组比较,差异有统计学意义(P: |2 v7 S- p5 c8 Z% v6 y# L2 {$ g( [
- u6 ~4 z, R8 X, y1 P/ S8 ]( A
2.3大体观察
0 T* q. t3 _' [+ d6 T5 s; b! N- @& E& [
实验组:术后6周,髌腱及髌骨背面见大量纤维组织增生,关节面光滑,截骨面可辨认,骨与腱接触面开始融合。12周,骨与腱部分区域已融合,截骨面不甚清晰。18周,骨与腱已融合,截骨面分辨不清。对照组:术后6周,髌腱及髌骨背面纤维组织增生明显,截骨面清晰。12周,截骨面清晰,骨与腱有融合趋势。18周,骨与腱大部分融合,截骨面隐约可见。
" Z" T/ `( ^: c/ b6 k! Q0 l6 ], y8 Z2 J  |3 j0 X0 K" Q
2.4组织学检查5 }: Z  [' W# r0 x  H- _( \. V

9 ]; _9 q8 ^, q- o# l; `2.4.1HE染色实验组:6周,大量纤维母细胞和类软骨细胞增生,部分类软骨细胞排列成条带状,大部分细胞排列紊乱,可见新骨形成,并向髌腱内长入,隐约可见截骨界面(图2a)。12周,髌腱与松质骨接触面软骨细胞移行带形成,可见新生骨形成,截骨界面不明显,细胞排列较前有规律(图2b)。18周,截骨面已消失,可见大量活跃新生松质骨,软骨移行带排列更加有序,胶原纤维及细胞排列较前有规律(图2c)。
& j( y2 y" ^7 X$ `
( \* w  s# @! p对照组:6周,纤维母细胞增生,截骨面清晰,无新骨形成(图2d)。12周,仍有纤维母细胞增生,截骨界面模糊,可见多量类软骨细胞和新生松质骨增生,排列较有规律(图2e)。18周,可见软骨带和新生骨形成,类软骨细胞含量较多,胶原纤维排列较前有规律,截骨面不明显(图2f)。
1 E; `7 r5 F! i. u6 d3 Y/ l2 Z* B* X
2.4.2Safranin 0染色实验组:6周,基质染色较深,新生骨与肌腱交界处的基质着红色,部分骨-腱结合处可见相对浓染区(图3a)。12周,基质染色范围明显减少,集中在部分骨-腱结合区的类软骨细胞聚集处,沿类软骨细胞走行分布,染色较浅。18周,骨-肌腱结合部类软骨细胞集中的区域被染成粉红色,较12周有所减退(图3b)。1 _  A7 W$ d2 p/ B6 T* U. T
! L7 n5 [, g# m" x4 Q0 ?+ D) ]
对照组:6周,基质染色较深,在骨-肌腱结合部有少量灶性分布染成红色的区域。12周,基质染色减少,可见骨-肌腱界面处有相对集中的基质红染区域,分布排列紊乱。18周,仍可见明显的基质红染,范围和程度有所增强(图3c)。图1术后18周髌骨前后位X线片,显示术后骨-肌腱接点愈合界面新骨生成(箭头所指处为密度较低的新生骨,虚线为最初截骨处,右上角直线为标尺=7 mm)1a.实验组1b.对照组图2髌骨-髌腱复合体HE染色1002a.实验组6周,大量的纤维母细胞和类软骨细胞增生(箭头所示)2b.实验组12周,髌腱与松质骨接触面软骨细胞移行带形成(箭头所示)2c.实验组18周,软骨移行带排列更加有序(箭头所示)2d.对照组6周,截骨面清晰,无新骨形成(箭头所示)2e.对照组12周,多量类软骨细胞和新生松质骨增生(箭头所示)2f.对照组18周,软骨带和新生骨形成,类软骨细胞含量较多(箭头所示)图3髌骨-髌腱复合体Safranin 0染色(100)3a.实验组6周,基质染色较深,新生骨与肌腱交界处的基质着红色(箭头所示)3b.实验组18周,基质染色较前减少(箭头所示)3c.对照组18周,仍可见明显基质红染(箭头所示)。0 |/ L  j6 R  K' n
; x. C5 C( ?) ^3 C- W* J  F
  3讨论
: z1 g! E9 ]: T: P& ]& ?: @9 z8 _' I" z
骨-肌腱结合部是肌腱、韧带或关节囊与骨接触的部位。特征性结构是移行的纤维软骨带。典型的纤维软骨性骨-肌腱结合部有四层组织结构:纤维结缔组织、非钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨。该部位愈合过程比较复杂,手术技术、方式,局部的生物力学环境[3],外固定时间等都对愈合和重塑产生重要影响。该部位的损伤,如跟腱或肩袖撕裂等愈合较慢。纤维软骨带的重建与修复对骨-腱结合部的愈合起到关键作用。
  B. p. }& {0 u
' z: w, @4 g: q9 M/ @近年学者对骨-肌腱结合部的愈合过程及如何促进其愈合进行了一些研究。Leung等[2]关于兔髌骨-髌腱复合体中骨-骨愈合和骨-肌腱愈合的比较研究显示骨-肌腱结合部在愈合界面之间及其周围区域形成大量瘢痕组织,瘢痕组织随愈合时间的推移逐渐重建。Wong等[4,5]发现软骨可能增强骨-肌腱结合部移行区的再生。徐钢、Lu等[6,7]发现低强度超声可以促进骨肌腱结合部的早期修复。陈鸿辉等[8]证实低强度超声和功能性电刺激可使骨、软骨等多种细胞增生,从而促进纤维软骨带重建和新骨形成。根据这项前期研究,作者想到BMSCs是多种间充质细胞的前体细胞,根据诱导环境的不同可分化为软骨、骨、肌腱等细胞,理论上可以促进骨—肌腱结合部多种细胞的增生,从而促进其愈合。近年Lim、Hong等[11,12]也发现BMSCs能促进骨隧道中骨-肌腱结合部的愈合。作者选用的细胞载体Pluronic F-127是由70%的聚氧化乙烯和30%的聚氧化丙烯构成的共聚物,能在不同温度下在固态和液态之间转化,平均降解时间为4~8周,对细胞增殖及活力无明显影响,无明显的免疫原性和抗原性[9,10]。& r6 K8 ?8 z5 a# r* b

* @6 u, W6 ?4 j" H6 B本实验X线片结果说明,部分髌骨切除术后残余髌骨长出新骨。但大部分标本新生骨以松质骨为主,仍不够致密,残余髌骨和新生骨之间会成为比较薄弱的区域,正如Lu等[7]发现在髌骨髌腱复合体拉力实验中,被拉断的部位往往是截骨处,而不是新骨和髌腱界面。HE染色显示相同时间点比较,实验组的新生骨质量及软骨带成熟程度均优于对照组。这提示随着愈合时间的延长,在新骨和肌腱接点处重新生成了相对致密的过渡性纤维软骨带,新的骨-腱接点逐渐形成,BMSCs对骨-腱愈合有明显的促进作用。Safranin O染色显示6周实验组骨腱接点有较多糖氨多糖,证实有大量类软骨细胞形成;12周基质分泌糖氨多糖减少,类软骨细胞带开始向成熟软骨细胞移行带转化;18周类软骨细胞更多地转变为成熟软骨细胞,软骨带形成较对照组快。作者的研究结果表明BMSCs能够促进骨-肌腱结合部细胞增生,增加细胞基质合成,促进新生骨和纤维软骨移行带形成。
0 A4 r( q( W  h
5 w# x  ?9 ]: o: V% a/ e" N综上所述,通过对兔部分髌骨切除模型的研究表明,骨—肌腱结合部随时间延长而逐渐恢复,骨髓间充质干细胞可以促进该部位早期愈合。
1 L. _; N+ K/ E4 w9 \$ G/ u; N1 Z. \
致谢:本院放射科李国耀、陈松主管技师协助本研究的X光拍摄,特此致谢!
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发表于 2015-6-14 19:41 |显示全部帖子
给我一个女人,我可以创造一个民族;给我一瓶酒,我可以带领他们征服全世界 。。。。。。。。。  

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真是天底下好事多多  

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角膜缘上皮干细胞

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发表于 2015-8-16 15:54 |显示全部帖子
不是吧  

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发表于 2015-9-27 23:18 |显示全部帖子
不知道说些什么  

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发表于 2015-9-29 15:54 |显示全部帖子
加油啊!!!!顶哦!!!!!  
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