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骨髓间充质干细胞促进骨-肌腱结合部愈合的初步观察

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发表于 2009-3-3 12:26 |显示全部帖子
作者:董飞 陈鸿辉作者单位:暨南大学医学院第四附属医院 广州市创伤外科研究所,广州  510220 8 X& C$ R6 j. R1 u2 d8 b* h
                  
, t  b0 l+ l: y7 \- P                  * X) r' U" W. {6 N
          1 Y  x9 @( z# j. z# p$ H
                        
3 Y4 a& h  n/ f, a            2 x/ w# ^1 y" q% c: ^
                    
' t$ W: M# s# Y. \2 E            
3 s4 B7 @. s" O  E. ^2 @6 t                     
2 {" Q% B! N9 {) k: q2 S  y        . U8 m: w3 i: R9 k
        
9 e2 ~. z5 i2 v. F/ F2 x9 _        
$ d4 U* f. m( B7 d& i/ b& ?          【摘要】  观察骨髓间充质干细胞对骨-肌腱结合部愈合的影响。[方法]采用骨髓穿刺、全骨髓培养法获取兔骨髓间充质干细胞。36只18周龄新西兰大白兔随机分为2组,实验组将骨髓间充质干细胞与Pluronic F-127载体材料结合后,植入兔髌骨部分切除模型,对照组只进行手术,不植入细胞。在术后6、12、18周进行X线片、大体和组织学观察评估。[结果]X线片显示术后6、12、18周实验组骨-肌腱结合部新生骨面积显著大于对照组(P" ?" Y" _: {$ v& v3 Q7 y, I6 d
          【关键词】骨髓间充质干细胞 骨-肌腱结合部 愈合
2 P- w% w0 F! M% ^3 Z/ P2 C! f                    Primary observation on bone mesenchymal stem cells accelerating bonetendon junction healing∥DONG Fei,CHEN Honghui,YANG Xiaohong,et al.Guangzhou Research Institute of Traumatic Surgery, The 4th Affiliated Hospital, Jinan University,Guangzhou 510220,China
+ W; h. W( z0 d+ V) e
, l; J$ x" b% C! QAbstract:[Objective]To evaluate tho effects of Bone Mesenchymal Stem Cells(BMSCs) on healing of bonetendon junction in a patellar tendon complex.[Method]The BMSCs of rabbits were harvested by bone marrow aspiration. Adherent cells were selected as BMSCs after the whole marrow was cultured.Standard partial patellectomy was conducted in 36 18weekold rabbits divided into 2 groups. The experimental group was planted into by the composite of BMSCs and Pluronic F127 while the control group was only operated without BMSCs planting into.The patellarpatellar tendon complexes were harvested at weeks 6,12,18 postoperatively for radiographic, gross and histological evaluations.[Result]Radiographic measurements showed significantly more newly formed bone at the patellar tendonpatellar healing junction in the experimental group compared with that of the controls at weeks 6,12,18(P( Y) j& e2 y; ]; o' {# N' E% Q
3 v) ^2 L3 q; G2 r# |
Key words:bone mesenchymal stem cells;bonetendon junction;healing
7 c6 n5 w# v" Y: [; t4 q7 a- r
* I& F, M" l) V! f& x: V* s& U多种原因导致的肌腱止点的损伤,如肩袖损伤、网球肘、部分撕脱型跟腱断裂等发病率逐年增高。骨-肌腱结合部愈合过程比较复杂,该部位的特征性结构纤维软骨带的再生十分缓慢和困难[1]。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是多种间充质细胞的前体细胞,有多向分化潜能,传代繁殖能力强,生物相容性好等优点。本研究将骨髓间充质干细胞移植入兔髌骨部分切除模型中[2],通过X线片、大体和组织学研究,观察其在骨-肌腱结合部修复中的作用。
" p, x: E  |* y: S, I8 V, Z# {6 Q* r. ~! E2 k: ^9 T, J; e
1材料与方法
2 t1 ]$ D$ B, d& ?+ r0 y* @* s, {. J2 X# f
1.1兔BMSCs体外分离,培养与扩增$ A  h0 @0 i. u$ k8 C2 M- I# D

2 T0 {* j* ?' m# G+ N' p8 W8周龄新西兰大白兔,无菌条件下抽取股骨干骺端骨髓3 ml,100目钢网过滤,1 200 r/min离心10 min,采用全骨髓培养法以(6~8)104/cm2置于75 ml培养瓶培养,每瓶含10 ml培养液(含青、链霉素各100 U/ml,体积分数为20%胎牛血清,αMEM),37℃、5%CO2孵箱中原代培养。4 d后半量换液,以后每48~72 h全量换液。当细胞融合达80%时,0.25%胰蛋白酶消化,以5104/cm2接种到培养瓶传代,收集第3代细胞供移植用。, t1 x. [& |* f
9 M; W  Y- p! L" L9 T# T
1.2BMSCs移植修复骨-肌腱结合部(bonetendon junction,BTJ)损伤
& S  u' f" \/ r: T  o3 u! {* C* K0 q6 k
1.2.1实验动物及分组36只18周龄新西兰大白兔,体重2.2~2.5 kg,随机分为实验组(BMSCs 载体Pluronic F-127)和对照组(只手术,不植入BMSCs和载体),分6、12、18周3个时间点,每个时间点6只。% K/ o' l: b/ W

. W( D5 B' @8 n3 V6 A1.2.2兔髌骨部分切除手术[2]麻醉下左下肢膝外侧入路,于髌骨远端1/3横行截骨,去除远端1/3髌骨,垂直近侧剩余髌骨钻2个0.8 mm的孔。髌韧带用不可吸收缝线缝合于近端髌骨上,实验组将BMSCs 载体复合物植入髌骨与髌腱之间,8字钢丝保护,膝关节石膏固定于屈膝90°位。6周后拆除石膏,笼内自由活动。在术后6、12、18周取材,分别作大体解剖检查,X线片分析及组织学观察。
4 a" p  j) g5 R8 K) ?7 I' ~8 e! X% N* _
5 t+ z) h0 D# T$ ~1.3X线片观察
6 J3 h( ]+ \, l
$ c! `; T/ H) W  t' y在标本X线正位片中找出手术截骨线,观察从近端残余髌骨长出的新骨,由同一个检测者用Image J图像分析软件分析测量,得出新骨面积定量数值。
9 a5 F( n  p9 s+ l5 ?% n( n3 J; G7 L0 l8 S
1.4资料的处理和分析方法" t/ z. Z3 q+ k3 f

: B& K+ i* L% Q! |8 pX线片用SPSS11.5统计软件处理,双因素方差分析,对实验组、对照组的差异性进行统计学分析,P≤0.05(双尾)为差异具有统计学意义。1 W7 y9 B) v* @" b
* e" O+ y* n3 X& a- E& |; u
2结果
  Q' V7 C7 R; h2 Y* m; T9 W* R; E: f/ E' [3 n% @* J; M
2.1BMSCs培养情况
/ b0 s: U# k7 f6 B$ P- q0 n, z8 w8 D) i  ^0 L/ e( H& V. ?
原代培养第6 d首次全量换液后,倒置显微镜下观察可见培养瓶中有许多增殖中的细胞克隆形成,克隆大小不一,最大可占据整个100倍视野,克隆中心向周围有放射状生长的贴壁细胞,形态多呈多角性、短梭形。随着换液,非贴壁细胞逐渐被弃掉。8~10 d后,各个集落之间基本融合达80%,予以传代,传代细胞呈长梭形,细胞生长密集时,其形态通常呈均匀一致的成纤维细胞样。
. E7 [% I1 a3 X; b- \4 Q- _
9 d0 \2 L8 r" [2 e9 r2.2X线片( f7 X. ]) x4 ]
( t9 ~" a. r- N- o
X线片经Image J软件处理,结果显示实验组6、12、18周的新生骨面积均明显增大(图1),与对照组比较,差异有统计学意义(P! s( r2 G$ T% b  \9 f
; o1 N1 `' c. v0 Q6 B) Q
2.3大体观察+ _6 T/ N( u" i5 t4 Z: e

$ \2 Y: X  }( r1 N实验组:术后6周,髌腱及髌骨背面见大量纤维组织增生,关节面光滑,截骨面可辨认,骨与腱接触面开始融合。12周,骨与腱部分区域已融合,截骨面不甚清晰。18周,骨与腱已融合,截骨面分辨不清。对照组:术后6周,髌腱及髌骨背面纤维组织增生明显,截骨面清晰。12周,截骨面清晰,骨与腱有融合趋势。18周,骨与腱大部分融合,截骨面隐约可见。
/ X1 W* B2 d% Q! v" R7 q9 {
5 L7 O4 e6 S/ K7 F2.4组织学检查
! U4 f9 c4 o. c2 L; }5 p
5 E$ J4 K: P+ Y9 e% \1 I9 l2.4.1HE染色实验组:6周,大量纤维母细胞和类软骨细胞增生,部分类软骨细胞排列成条带状,大部分细胞排列紊乱,可见新骨形成,并向髌腱内长入,隐约可见截骨界面(图2a)。12周,髌腱与松质骨接触面软骨细胞移行带形成,可见新生骨形成,截骨界面不明显,细胞排列较前有规律(图2b)。18周,截骨面已消失,可见大量活跃新生松质骨,软骨移行带排列更加有序,胶原纤维及细胞排列较前有规律(图2c)。
7 @, n$ d  i( Q9 m$ @' x  n
, j) B7 F# a8 h( f9 X对照组:6周,纤维母细胞增生,截骨面清晰,无新骨形成(图2d)。12周,仍有纤维母细胞增生,截骨界面模糊,可见多量类软骨细胞和新生松质骨增生,排列较有规律(图2e)。18周,可见软骨带和新生骨形成,类软骨细胞含量较多,胶原纤维排列较前有规律,截骨面不明显(图2f)。
- F3 r8 `+ p* j8 u- U, k' c8 n* E" R! R; d0 h+ l2 G. X
2.4.2Safranin 0染色实验组:6周,基质染色较深,新生骨与肌腱交界处的基质着红色,部分骨-腱结合处可见相对浓染区(图3a)。12周,基质染色范围明显减少,集中在部分骨-腱结合区的类软骨细胞聚集处,沿类软骨细胞走行分布,染色较浅。18周,骨-肌腱结合部类软骨细胞集中的区域被染成粉红色,较12周有所减退(图3b)。
- ^& o) t+ t6 d$ [' P% s0 D
. _, v+ \/ M0 ~  j对照组:6周,基质染色较深,在骨-肌腱结合部有少量灶性分布染成红色的区域。12周,基质染色减少,可见骨-肌腱界面处有相对集中的基质红染区域,分布排列紊乱。18周,仍可见明显的基质红染,范围和程度有所增强(图3c)。图1术后18周髌骨前后位X线片,显示术后骨-肌腱接点愈合界面新骨生成(箭头所指处为密度较低的新生骨,虚线为最初截骨处,右上角直线为标尺=7 mm)1a.实验组1b.对照组图2髌骨-髌腱复合体HE染色1002a.实验组6周,大量的纤维母细胞和类软骨细胞增生(箭头所示)2b.实验组12周,髌腱与松质骨接触面软骨细胞移行带形成(箭头所示)2c.实验组18周,软骨移行带排列更加有序(箭头所示)2d.对照组6周,截骨面清晰,无新骨形成(箭头所示)2e.对照组12周,多量类软骨细胞和新生松质骨增生(箭头所示)2f.对照组18周,软骨带和新生骨形成,类软骨细胞含量较多(箭头所示)图3髌骨-髌腱复合体Safranin 0染色(100)3a.实验组6周,基质染色较深,新生骨与肌腱交界处的基质着红色(箭头所示)3b.实验组18周,基质染色较前减少(箭头所示)3c.对照组18周,仍可见明显基质红染(箭头所示)。" }9 L9 g- Y) Q: C4 e2 l" c

5 a( l4 V6 X* ~' H  3讨论! |  Q. ?" A/ i2 G/ V2 ~/ }& E4 Q
9 c  u0 e1 K6 _5 q' F/ [6 Y
骨-肌腱结合部是肌腱、韧带或关节囊与骨接触的部位。特征性结构是移行的纤维软骨带。典型的纤维软骨性骨-肌腱结合部有四层组织结构:纤维结缔组织、非钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨。该部位愈合过程比较复杂,手术技术、方式,局部的生物力学环境[3],外固定时间等都对愈合和重塑产生重要影响。该部位的损伤,如跟腱或肩袖撕裂等愈合较慢。纤维软骨带的重建与修复对骨-腱结合部的愈合起到关键作用。/ Z$ c+ o4 e3 u5 A& s: ?

, p  o: J; I: S- x近年学者对骨-肌腱结合部的愈合过程及如何促进其愈合进行了一些研究。Leung等[2]关于兔髌骨-髌腱复合体中骨-骨愈合和骨-肌腱愈合的比较研究显示骨-肌腱结合部在愈合界面之间及其周围区域形成大量瘢痕组织,瘢痕组织随愈合时间的推移逐渐重建。Wong等[4,5]发现软骨可能增强骨-肌腱结合部移行区的再生。徐钢、Lu等[6,7]发现低强度超声可以促进骨肌腱结合部的早期修复。陈鸿辉等[8]证实低强度超声和功能性电刺激可使骨、软骨等多种细胞增生,从而促进纤维软骨带重建和新骨形成。根据这项前期研究,作者想到BMSCs是多种间充质细胞的前体细胞,根据诱导环境的不同可分化为软骨、骨、肌腱等细胞,理论上可以促进骨—肌腱结合部多种细胞的增生,从而促进其愈合。近年Lim、Hong等[11,12]也发现BMSCs能促进骨隧道中骨-肌腱结合部的愈合。作者选用的细胞载体Pluronic F-127是由70%的聚氧化乙烯和30%的聚氧化丙烯构成的共聚物,能在不同温度下在固态和液态之间转化,平均降解时间为4~8周,对细胞增殖及活力无明显影响,无明显的免疫原性和抗原性[9,10]。
" H0 A" f" w" E% |* D; g8 k% _1 _3 d
本实验X线片结果说明,部分髌骨切除术后残余髌骨长出新骨。但大部分标本新生骨以松质骨为主,仍不够致密,残余髌骨和新生骨之间会成为比较薄弱的区域,正如Lu等[7]发现在髌骨髌腱复合体拉力实验中,被拉断的部位往往是截骨处,而不是新骨和髌腱界面。HE染色显示相同时间点比较,实验组的新生骨质量及软骨带成熟程度均优于对照组。这提示随着愈合时间的延长,在新骨和肌腱接点处重新生成了相对致密的过渡性纤维软骨带,新的骨-腱接点逐渐形成,BMSCs对骨-腱愈合有明显的促进作用。Safranin O染色显示6周实验组骨腱接点有较多糖氨多糖,证实有大量类软骨细胞形成;12周基质分泌糖氨多糖减少,类软骨细胞带开始向成熟软骨细胞移行带转化;18周类软骨细胞更多地转变为成熟软骨细胞,软骨带形成较对照组快。作者的研究结果表明BMSCs能够促进骨-肌腱结合部细胞增生,增加细胞基质合成,促进新生骨和纤维软骨移行带形成。
9 P; W% w7 _% b: Q0 T$ ]% _3 M9 L6 J* J. l# i( H
综上所述,通过对兔部分髌骨切除模型的研究表明,骨—肌腱结合部随时间延长而逐渐恢复,骨髓间充质干细胞可以促进该部位早期愈合。
& E6 w5 I0 {8 P  _) A: T/ A% G( X3 z2 {" T9 Y) {
致谢:本院放射科李国耀、陈松主管技师协助本研究的X光拍摄,特此致谢!! c4 P$ v. R5 y4 V6 v
          【参考文献】
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发表于 2015-6-14 19:41 |显示全部帖子
给我一个女人,我可以创造一个民族;给我一瓶酒,我可以带领他们征服全世界 。。。。。。。。。  

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真是天底下好事多多  

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不是吧  

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发表于 2015-9-27 23:18 |显示全部帖子
不知道说些什么  

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发表于 2015-9-29 15:54 |显示全部帖子
加油啊!!!!顶哦!!!!!  
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