间充质干细胞的基础和临床应用研究进展 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:26 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：李晓春  陈鹏作者单位：浙江大学医学院附属第二医院老年科，浙江  杭州  310009
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      【关键词】间充质干细胞；细胞治疗；临床研究8 l: x9 K3 Q7 g: |8 H, B1 w
   　　组织工程学是刚刚发展起来的新兴应用学科，是利用体外培养的方法将某些具有干细胞特性的细胞诱导分化为目的组织或器官以供临床所需。组织工程学的关键在于得到能分化为所需组织的干细胞，其次是使干细胞分化为特定组织的条件。最近许多研究表明，人类、啮齿类、鸟类等动物的骨髓中可分离出一种细胞，它具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、肌管、内皮及神经分化的潜能，这就是间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）〔1〕。3 S5 F5 }$ n" I# i$ I

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　　干细胞独特的生物学特征和诱人的应用前景，与组织工程相结合成为21世纪生命科学研究领域的热点之一。尤其是成年干细胞跨系统、跨胚层分化潜能的发现，不仅对细胞生物学理论的发展有重大意义，而且对心血管、肿瘤、免疫、遗传等方面疾病的治疗以及器官重建和损伤修复具有深远的影响。最新研究发现，成体干细胞可以横向分化（transdifferentiation）为其他细胞和组织类型，为其广泛应用提供了理论依据和实验基础〔2，3〕。目前在成体干细胞研究领域中，MSCs备受注目。' C# f5 Y, z5 a* w1 b/ {6 j; n
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　　1MSCs的分离培养及鉴定) a3 A% m( ]- F1 U

　　1.1分离方法用于分离MSCs的方法有4种：密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞分选法和磁珠分离法。目前MSCs的分离培养主要采用密度梯度离心法和贴壁筛选法结合，达到分离纯化的目的。密度梯度离心常用的分离剂有Percoll和Ficoll，两者理化特性不同，分离效果也不同。但经过分离剂分离后，所获得的贴壁细胞同源性好。限定性传代培养及冻存复苏后，细胞生物学特性及分化潜能保持不变。目前国内外大多数实验室均采用此种方法。
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　　1.2培养二维培养技术已普遍应用，尽管逐步得到改善，但仍存在着难以克服的缺点：①贴壁表面积有限，细胞产量低；②无菌操作过程繁琐，容易污染；③代谢产物逐渐积累，排除不及时易引起细胞生长不良甚至退化；④细胞离开了体内同细胞外基质共同构成的三维立体结构，生物学行为受到影响，容易变异。除此之外，利用干细胞进行诱导分化研究，二维培养体系不能满足需要，因此有人提出三维培养的设想。Glowacki用胶原海绵作为载体进行三维灌注培养，减少了代谢产物的聚集，结果发现细胞外基质含量增高，所培养的细胞活性和功能均增强〔4〕。但cytodex3和胶原海绵均为实心载体，表面积较小，细胞难以大规模扩增，而大载体生物反应器已成功用于某些植物和动物细胞的大规模离体培养，能否将其应用于MSCs的扩增培养，并形成产业化，从而满足细胞工程和基因工程对种子细胞量的需求，还有待于一些问题的顺利解决，如大孔微载体的研制、细胞与载体的黏附、贴壁细胞的洗脱等。
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　　1.3鉴定由于目前尚缺乏MSCs的特异性标志，对MSCs的特征描述及其分离方法都是以细胞群体的形式进行。许多研究表明，MSCs能表达多种表面抗原，但只具有相对特异性，因此人们一直致力于特异性抗体的研究。1991年Simmons等利用STRO1抗体富集MSCs〔5〕；1992年Haynesworth用人骨髓基质细胞免疫小鼠，筛选出3个杂交瘤即SH2、SH3、SH4，其产生的抗体识别人MSCs，而不与骨髓造血细胞系、骨髓基质成纤维细胞反应，也不与成骨细胞和骨细胞反应，因此认为SH2、SH3、SH4这三种抗体是目前鉴定人MSCs的特异性抗体〔6〕。直到1999年，Barry与Haynesworth首次利用SH2单克隆抗体，从人MSCs中分离纯化该抗原，通过多肽序列分析和质谱测量法确定为CD105，并作为MSCs的细胞表面标志〔7〕。随后SH3、SH4两种抗体所识别的不同抗原决定簇也确定为CD73〔8〕。另有研究报道，MSCs可特异表达SB10，它与激活的白细胞黏附分子相同，并且在分化过程中消失〔9〕。最近，Quirici等发现并利用低亲和力神经生长因子受体抗体，从骨髓中分离出同源性较高的MSCs，并证明具有多分化潜能，已获得成功〔10〕。随着对MSCs表面抗原的研究，人们会找到越来越多的抗体对其分离鉴定。
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　　由于MSCs没有特异性表面标志物，所以目前采用联合鉴定方法：细胞化学、免疫组化及流式细胞分析方法。MSCs具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原（PAS）阳性，酸性磷酸酶（ACP）及苏丹黑（SB）阴性，根据这些特点，可达到初步鉴定的目的。进一步鉴定通过免疫组化方法，MSCs表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166等表面抗原〔11〕。不表达分化相关标志如Ⅱ、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白等，也不表达造血系统标志，包括CD14、CD34及白细胞共同抗原CD45。最后用流式细胞分析方法，鉴定MSCs这种细胞群的同源性或者纯度，Haynesworth的研究小组进行流式细胞分析显示，原代培养细胞同源性可达到95%～98%，二代以后可达100%〔12〕。国内实验室通过检测CD29、CD44、CD45、HLADR，发现二代以后细胞纯度可达到95%以上〔13〕。

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　　除了采用以上联合方法鉴定外，人们根据MSCs具有多向分化潜能的特点，对其采用反证法。所以许多实验室将MSCs在体外诱导分化，如果可分化为多种间充质细胞，则说明所分离的细胞为MSCs，或者在体外将细胞大量扩增，然后直接注入体内，在微环境作用下，细胞可分化为骨、软骨、脂肪等细胞系，从而反向证明所分离的细胞是MSCs，而不是成熟细胞。. ]3 @5 |4 l  s' ?! W" x

　　2MSCs的生长动力学特点
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　　2.1MSCs的生长特性人间充质干细胞（hMSCs）原代培养时，分为3个生长时期：生长停滞期、对数生长期和生长平台期。传代培养细胞同样具有这3个时期。传代细胞形态均为梭形，直到出现明显的衰老标志，形态变为伸展扁平状，有丝分裂停止，细胞碎片和应力纤维聚集，最终发生变性。除此之外，免疫表型也发生改变。MSCs中大约有20%细胞处于静止期，即G0期细胞，这表明MSCs具有强大的增殖能力。在体外每传一代，细胞数量就增加2.4倍，群体倍增潜能可作为生物年龄的测定指标。hMSCs的群体倍增潜能介于胚胎和成熟组织之间，说明这种细胞比其他正常成熟细胞生物年龄年轻，是胚胎和成体细胞之间的中间态。尽管MSCs有强大的增殖能力，但高度传代（＞25代）的MSCs中有一部分已经表现出凋亡，而且高度传代的MSCs失去其特异的表面抗原SH3、CD29，细胞外基质产生也减少，对DNA含量及抗原Ki67检测表明，MSCs在传代中发生了自发凋亡，但并不表达衰老相关的半乳糖苷酶〔11〕。而Bruder研究发现，MSCs出现的反应性衰老并不代表终末分化阶段，因为这些细胞在各代次中仍保持骨分化潜能。
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　　2.2MSCs自我更新和调控机制干细胞通过两种方式产生子代细胞〔14，15〕：一种是细胞不变性非对称分裂，产生一个子代干细胞和一个具有限定性增生潜能的前体细胞，这种方式在单细胞生物和无脊椎动物中（如果蝇卵巢）多见。另一种方式的细胞群的非对称分裂，属于高等调节机制，即干细胞分裂可能产生两个子代干细胞，也可能产生两个前体细胞，后者对外源性调节因素和细胞外基质发生反应而沿不同方向分化，因此命名为过渡扩增性细胞群，其功能主要是扩增终末分化细胞。扩增性细胞群一般可分裂3次，因此1个干细胞分裂1次后可产生8个终末分化细胞。干细胞的这种分裂方式可能是由细胞决定簇的非对称分布决定，这种分裂不是对单个细胞而言，而是整个细胞群表现为非对称性，其原因可能是细胞行为本身具有连续性，干细胞和前体细胞是在分化谱系的两端，而不是两种分离的细胞群。非对称分裂可适应机体的不同生理反应需要，例如当机体损伤之后，造血或表皮干细胞产生的子代细胞数量增加〔16〕。

　　3MSCs跨系统跨胚层分化& m  c- _$ r  K9 E/ f6 v7 n! Z
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　　最近研究发现，成体干细胞不但能增殖，而且在一定外界条件下具有跨系统跨胚层分化能力，这种特性又称可塑性（plasticity）〔17〕。通常情况下，供体干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞，而在某些情况下干细胞分化并不遵循此规律。关于横向分化的调控机制目前还不太清楚，大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关。一种可能是成体干细胞本身就是亚全能或多能干细胞，具备多向分化潜能，同时又具有维持未分化状态的基因程序。由于成体干细胞在发育过程中被自然分割在不同的组织中，其所处微环境只适合向该组织发育分化，一旦微环境发生改变，干细胞对分化信号的反应，受到周围正在进行分化的细胞影响，从而对新的微环境中调节信号做出反应，便能分化成其他系统的细胞〔18〕。另一种可能是任何细胞，即便是完全分化成熟的体细胞，都有逆分化（基因功能重新编序）恢复全能性的可能，导致细胞重新分化。
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　　随着成体干细胞横向分化的大量研究，许多科学家对此持保留态度。2002年8月23日《Science》发表了美国贝尔医学院Shine等题为骨髓细胞在体内不能横向分化为神经细胞的研究报告，这是骨髓细胞在体内不能横向分化为神经细胞的最新证据〔19〕。Shine等认为成年骨髓SP细胞或源自SP细胞的子代细胞，在实验条件下是不能发生横向分化的。因此，“骨髓变脑”的横向分化可能不是一个共性。紧随其后，《Science》在9月27日又刊发了当今国际干细胞基础研究领域最具权威的专家、美国斯坦福大学医学院Weissman教授：成年造血干细胞发育可塑性证据不足的研究报告〔20〕。为证明骨髓造血干细胞(HSC)在体内的分化命运，他们采用移植单一标志基因的GFP CKit Thy1 LinSca1 骨髓HSC，结果表明绝大多数非造血组织系统，如脑、肾、肠、肝及肌肉中并未发现GFP阳性非造血细胞，无明显的横向分化现象。虽然不同实验室所做的研究结果很难加以对比，但是横向分化的确被过度夸大渲染〔21〕。6 e4 y; E/ e! Z+ B; ?
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　　4MSCs的实验性治疗# B8 F3 R0 w9 F9 G; J2 }

　　4.1基因治疗目前关于MSCs的基因治疗有以下方法：①目的基因转染MSCs，然后将细胞注入，当细胞归巢到骨髓后就可分泌治疗性蛋白。或者将分泌治疗蛋白的MSCs用一种惰性材料包裹，使蛋白弥散。Krebsbach等人〔22〕用Ⅸ因子基因转染人MSCs，注入到SCID小鼠中，至少8 w内可检测到这种蛋白的分泌。因此基因工程中的MSCs，是血友病B和其他由于循环蛋白缺乏而导致的遗传性疾病治疗的有效载体工具。②在一定条件下注入MSCs，不仅在骨髓中重建形成细胞群，而且可根据部位特异分化为骨、软骨和神经细胞。研究发现，来自正常供体小鼠的MSCs注入胶原基因突变的小鼠中，受体小鼠的骨、软骨和脑中正常供体细胞替代率可达30%〔23〕。因此从严重骨生成缺陷患者的骨髓中分离MSCs，通过培养同源重组替代突变的Ⅰ型胶原基因，然后回输给患者，在Ⅰ期临床治疗阶段，已表现出很好的耐受性和疗效性。③采用逆转录病毒载体携带人IL3和绿色荧光蛋白转染人MSCs，转染后细胞在体外仍可分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，并保持转基因表达，然后将这些细胞经皮下、血管内和腹膜内注入NOD/SCID小鼠。外周血检测显示，全身性的hIL3表达维持在100～800 pg/ml，并超过3个月。这项研究说明，人MSCs能有效表达治疗基因，并作为系统性基因治疗的一种细胞运载工具〔24，25〕。此外，狒狒、犬科、大鼠、绵羊、山羊、猪和兔MSCs都可以作为一种携带目的基因工具，用于骨髓基质重建和癌相关的细胞毒性治疗〔26〕。! D: J, D" S8 r& \) v  x! [; y5 G

　　4.2恶性肿瘤治疗+ s& i; r' w+ n; ]; p3 J

　　4.2.1肿瘤放化疗后的支持治疗许多研究表明烷化剂和放疗都会破坏骨髓微环境，削弱造血功能。而MSCs是骨髓微环境的重要组成部分，可支持造血。因此，MSCs协同造血干细胞(HSCs)移植，可优先重建骨髓微环境，改善HSCs的植入速度和效果，尤其对于骨髓受到破坏的患者。2000年Koc等将乳腺癌患者自身MSCs分离，然后与外周血HSC一同回输，这是第一个自体的hMSCs治疗实验。通过检测外周血的中性粒细胞和血小板数量，发现回输hMSCs的患者造血功能可快速恢复。这说明肿瘤化疗之后导致的重度骨髓抑制，应用MSCs会促进造血功能的快速重建〔27〕。, ~0 k4 n) [4 h: b  i

　　4.2.2免疫耐药治疗对于一些放化疗不敏感或经过多次化疗而产生耐药性的恶性肿瘤患者，免疫治疗带来新的希望。以hMSCs作为细胞载体，扩增逆转录病毒基因重组的G156A/MGMT，该基因可编码一种烷基转化酶alkyltransferase（AGT），在人造前体细胞中，该酶具有耐药拮抗性，可拮抗O6benzylguanin（BG）苯甲基鸟嘌呤、烷化剂双氯乙亚硝脲(BCNU)和替莫唑胺(temozolomide，TMZ）协同产生的耐药性。29%转染的造血细胞可表达AGT，耐药性是未转染细胞的5倍。26%hMSCs被同时转染，并作为支持细胞表达AGT发挥耐药拮抗性功能〔28〕。

　　4.3神经系统细胞治疗脑组织微环境中，FGF2和神经生长因子具有保护MSCs、促进增殖并向神经细胞分化的能力。Azizi将人的MSCs注射入大鼠脑内发现其在脑组织内以类似星行细胞的行为迁移〔29〕。Kopen进一步证明〔30〕，注射入新生鼠外侧脑室的MSCs，通过小鼠的前脑和小脑，到达宿主大脑内，其中部分MSCs分化为成熟的星型细胞，也有部分MSCs在海马嗅觉岛等神经元富集区增殖，另有大量的MSCs在小脑外颗粒层表达神经微丝，表明供体的MSCs可能已经分化成神经元。Schwarz等将基因工程和细胞治疗联合应用，将酪氨酸羟化酶（TH）和GTP水解酶Ⅰ的基因转入MSCs中，将此细胞输入帕金森症大鼠模型中，切除纹状体后，在体内仍可检测到左旋多巴（LDOPA）及其代谢产物，并持续表达9 d〔31〕。以上这些研究表明，MSCs是中枢神经系统疾病基因治疗的有效载体。

　　4.4心脏修复的细胞治疗临床常用的用于心脏修复的干细胞治疗途径有3条：冠状动脉内途径，经导管心内膜注入心室途径以及外科微创的心外膜心肌注入途径。经导管冠脉内注入的优点在于细胞能直接进入到有血流供应的心肌局部，这是保证移植细胞存活的前提和有利条件，但不利的是它必须从血管中迁移并归至靶治疗目标的无灌注心肌部位，其靶向性可能非常低。通过导管心内膜或者开胸心外膜途径将MSCs直接注射到瘢痕组织或冬眠心肌部位，虽然不受到从循环中摄取到多少干细胞的影响或栓塞的危险，但在急性心梗时，却有心室穿孔的危险；此外，将MSCs注入不能进行细胞间信号传递也无血流供应养料的坏死心肌组织，究竟能否获得植入且分化的环境，尚值得商榷。观察的结果确有显示，直接注射后，大多数细胞的命运是死亡。通过电机械作图方法可能帮助发现存活但处于“冬眠”的心肌，从而精确注射部位。
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　　从临床实际情况看，造成每个病人心脏功能不全的病理基础不一样，这必将影响干细胞治疗途径的选择，现有的临床研究背景不一，目前还无法断言，哪种细胞类型最理想，什么输注途径最佳。目前，MSCs的临床治疗还大多局限动物实验，部分临床实验的结果亦存在较大争议和分歧〔32〕，离临床应用尚有很大距离〔33〕。将来需在大动物和与人类相近的灵长类动物身上验证MSCs的治疗作用，以便更好地应用临床。我们目前尚不清楚MSCs在体内增殖分化的特异条件，但在体外已可成功地将其诱导分化为骨、软骨、脂肪及肌组织，这为MSCs在组织工程中的应用打下良好基础，并且在动物及人类的部分临床实验中取得一定疗效，它将为今后临床创伤修复提供可行的治疗手段。  n/ C1 @! H4 U# L! A( y8 ?1 x
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　　5展望
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　　完美地修复或替代因疾病、战伤、意外事故或遗传因素所造成的组织、肢体或器官的伤残，一直是人类的梦想和难以攻克的医学高峰。利用干细胞工程和现代生物医学技术，有可能使这一难题和梦想成为现实。) p6 J- {1 U8 U7 {7 W

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　　目前，干细胞研究方兴未艾。MSCs因其具有易于扩增和诱导分化的干细胞特性，加之其来源丰富，采集方便及其移植后的特殊免疫耐受特点，向人们展示了其在组织损伤修复及替代方面的广阔的应用前景。

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　　MSCs作为重要的种子细胞，无论从它的来源、分离方法及分化的组织类型上都有其独特的优势，但MSCs的研究面临着几个亟待解决的问题。如MSCs的特异性的标志分子是什么？如何获得更为纯化的MSCs？寻找和鉴定MSCs所特有的细胞表面标志分子，对其分离和培养具有重要意义。鉴于成体组织中存在多种类型的早期细胞，寻找一个更好的鉴定骨髓及远缘组织中的MSCs的方法，是间质发育学研究的范畴，也是MSCs应用研究的当务之急。其次，分化潜能及功能研究将拓展MSCs应用的范围，发现不同来源，不同特性的分化潜能将扩大MSCs治疗疾病的适应证，如MSCs向心肌细胞分化，可应用于急性心肌梗死后的治疗和恢复〔34〕，向胰岛和肾小管上皮细胞分化，可用于糖尿病和肾小球肾炎的治疗。MSCs作为骨髓基质组分之一，可支持造血并分化为多种间质细胞，单独或HSC共移植，将有助于HSC的植入。再者，干细胞生存的微环境中调控其增殖、更新和分化的关键作用因子及机制也有待进一步研究和挖掘。' I% M& n0 h- V' C+ b0 E) K; g
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　　但是，相信随着对这些问题的一一解答，不久的将来，人们会以MSCs为突破口，有希望实现让损伤的组织或器官得以“完美”修复或替代的梦想，真正使现代组织工程造福于人类，从移植器官步入制造器官的时代！
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