老龄兔骨髓间充质干细胞体外培养影响因素的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:25 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：王晔玲赵学忠郑连文秦玲　汲宏磊  李洋张志国杨世杰作者单位：吉林大学第一医院心血管内科，吉林长春  130021
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      【摘要】  目的研究体外培养老龄兔骨髓间充质干细胞（MSCs）的影响因素。方法以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合,在体外分离检测MSCs表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达；诱导分化反向证明部分细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞，具有分化潜能，鉴定该细胞群为干细胞。细胞记数法计算MSCs倍增时间；观察供体自然老龄情况下，不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对MSCs生长的影响。结果 MSCs CD29和CD44表达阳性，不表达造血干细胞标志CD34和CD45。高密度接种(3×106～4×106个/cm2)，低浓度(8％～10％)血清的低糖DMEM培养，在体外可保持MSCs未分化增殖状态，并获得纯度较高同源性较好的干细胞群，高浓度血清 (20％)并不加速细胞生长，而促进分化。结论 MSCs具有体外多分化潜能，老龄供体骨髓中MSCs的生长、增殖特性受不同换液时间、不同血清浓度及不同种植密度等因素的影响。
      【关键词】老龄兔；骨髓间充质干细胞；细胞培养- V, t: Y9 v6 _6 p
   　　The affected factors of MSCs cultured in vitro in aged rabbits

　　WANG YeLing, ZHAO XueZhong, ZHENG LianWen，et al' @8 r4 a# a( x: k/ J# C* E
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　　Department of Cardiovascular, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China  \4 ~* P2 {8 k5 o, `; |: y

　　【Abstract】Objective To investigate the influential factors of mesenchymal stem cells (MSCs) of old rabbits cultured in vitroMethods MSCs were separated and purified from the rabbit bone marrows blood with density gradient centrifugation and adherence screening method to detect expression of surface antigen (sAg) of CD29, CD34, CD44, CD45 by flow cytometry and to certificate cell differentiation to skeltogenous cell and adipose cell by derivation, and to identify the cell mass as stem cell The double time of MSCs was calculated by kytocounting method to observe the effect factors of MSCs growth in different time of changing liquid, at different blood serum level and different growth densityResultsCD29 and CD44 were positive in MSCs, however CD34 and CD45 were negative The cell group maintained the nondifferentiation and nonproliferation cultured in vitro at the highdensity inoculation (3106～4106 cell/cm2) and low blood serum level (8%～10%) of low glucose with DMEM to obtain stem cell group of the higher purity and better homology High blood serum level (20%) did not accelerate cell growth, but promote the cell differentiationConclusionsMSCs have the potential ability of multidifferentiation in vitro, many factors could affect the proliferation characteristics of old rabbit MSCs in vitro, including the time of changing liquid, blood serum level and growth density etc4 L# `& I: D. O/ r$ ]$ m

　　【Key words】Aged rabbits; Mesenchymal stem cells (MSCs); Cell culture& W- n* y2 F2 J9 K) P- }: s- {

　　自体骨髓间充质干细胞（MSCs）移植是用于心肌修复的种子细胞来源之一，人们对其基本生物学特性和多能性进行了大量研究，不同年龄阶段MSCs传代时间、衰老和凋亡情况不尽相同，不同年龄阶段MSCs的培养方法和条件有不同的要求。尤其是来自老龄供体的种子细胞随着增龄和其他器官系统的功能降低一样，MSCs的生长能力也在退化、老化，从而丧失分泌基质的功能，因此须掌握老龄供体骨髓MSCs的含量以及其生长、增殖特性、接种密度等各项参数，为体外大量扩增并保持未分化增殖状态，进一步应用和研究MSCs奠定实验技术基础。
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　　1 材料与方法7 B4 P* @  C* p' u& v

　　11试验动物: r8 P/ d8 ?$ g4 i- d, m+ }) P
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　　36个月龄新西兰大白兔，购自吉林大学白求恩医学部实验动物中心。

　　12试剂3 f) i2 I  h! m  I* o

　　基础培养液LDMEM (GIBCO BRL，USA)、优等胎牛血清(GIBCO公司，USA)、青链霉素双抗100 U/ml(基础培养液)、 Percoll分离剂(Pharmacia，Biotec，USA) 、一抗CD29、CD34、CD44、CD45；FITC抗小鼠IgG和FITC抗羊IgG分别购自Neomarker和博士德公司。100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β甘油磷酸钠；50 μmol/L抗坏血酸。台式自动平衡离心机LDZ52 (北京医用离心机厂)、高速低温离心机(Werk Nr，Micro 22 R 德国）、CO2孵箱(SANYO MCO17AIC 日本)、超净工作台(苏净集团安泰公司)、倒置显微镜(Olympus 日本)、相差显微镜(IX70，Olympus 日本)、全能显微镜(AX70,Olympus 日本)、激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV500，日本)、FACS(Becton Dickinson 美国)、24孔板(Coster/Falcon/Nunc BD，USA)。

　　13 细胞分离与培养

　　取36月龄新西兰大白兔3%戊巴比妥钠1 ml/kg(30 mg/kg) 耳缘静脉缓慢注射麻醉，股骨大转子后方穿刺入骨髓腔，用含有01 ml肝素(6 250 U/ml)的10 ml 注射器负压吸取骨髓血2～5 ml,与等量LDMEM混合，800 r/min,8 min使细胞形成微团。弃上清及脂肪层，再用LDMEM重悬细胞，以等体积比轻轻叠加在Percoll（1073 g/ml）液面上。2 500 r/min，离心30 min，抽取培养液与分离液液面之间的乳白色细胞层(单个核细胞层)，加入LDMEM冲洗，1 200 r/min,离心8 min，反复两次，以便洗净细胞悬液中的Percoll。用含10%胎牛血清的LDMEM (内含双抗100 U/ml)重悬细胞，计数细胞，以3～4106个细胞/cm2接种在24孔板中。接种3 d后换液，可见贴壁细胞。以后每隔4～5 d更换一次培养液。待细胞80%～90%融合时，弃去培养液，加入025%胰酶，37℃消化2 min左右。吸取细胞悬液离心洗涤，培养液重悬细胞，以1∶3在培养瓶中进行扩增培养，此为第1代细胞。同上方法，细胞依次传代为第2代、第3代，直至第5代。

　　14不同条件细胞培养与处理& U5 X8 X1 ~8 q% x$ U

　　(1)观察相同接种密度不同换液时间对原代MSCs数量的影响：以3～4106个/cm2接种于24孔板，分别在接种后第2、3、4天首次换液。(2)不同血清浓度对传代MSCs生长的影响:取3代细胞,分别以无血清培养液、含10%胎牛血清的培养液、含20%胎牛血清的培养液培养。(3) 不同种植密度对原代、传代MSCs生长的影响：低密度接种(1104个/cm2)、中密度接种培养(1105个/cm2)、高密度接种培养(1106个/cm2)；分别采用低比例1∶2、1∶3传代及高比例传代(1∶4)。& ~& R. J& }  W+ Q5 k! U+ ?

　　15 流式细胞仪分析法(FACS)

　　胰酶消化收集细胞，使其浓度达到106个/ml。细胞重悬于500 μl PBS中冲洗2次，1 500 r/min，离心5 min，弃去PBS，与一抗孵育液常温下孵育30～40 min。加入500 μl PBS，冲洗2次，1 500 r/min，离心5 min，弃去PBS，与FITC－二抗4℃孵育20～30 min，加入500 μl PBS，冲洗2次，1 500 r/min，离心5 min，弃去PBS，再加入500 μl PBS重悬细胞，用于FACS分析。! A1 u1 D8 S" S

　　16 诱导分化反向证明法(成骨分化、脂肪分化) 细胞接种后24 h，弃去培养液，PBS冲洗三次，添加条件培养液(含10％FCS的LDMEM；100 nmol/L地塞米松；10 mmol/L β甘油磷酸钠；50 μmol/L抗坏血酸)及向脂肪分化的诱导剂，每隔3～4 d更换培养液，作用9～14 d。
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　　17 统计学分析1 o* ^' F/ i' s1 u. k& R& `( i' I
+ I/ d* w. Q3 H/ h7 n9 U' X8 \
　　数据结果以x±s表示，根据资料类型采用t检验，秩和检验，统计软件为SPSS和Instat。1 `# w' n6 [$ @/ m2 B
1 N2 y0 h/ b' M2 L; c
　　2 结果
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　　21 贴壁细胞的鉴定

　　211 MSCs生物学特性+ v3 M9 }7 q" ~! ?7 z( E

　
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　　接种3 d后，首次换液弃去未贴壁造血细胞，贴壁细胞为成纤维细胞样，在原代培养的5～10 d内，贴壁的MSCs生长缓慢，细胞形态清晰，两端有长突起，核呈椭圆形。10 d后细胞迅速增殖，呈鱼群样或漩涡状排列，这时细胞贴壁紧密，扁平，胞体狭长。血细胞随换液全部清除，贴壁细胞形态比较一致，可进行第一次传代培养。传代MSCs形态上更加趋于一致，均为成纤维细胞样，紧密排列，界限不清，生长旺盛。每隔3天换液，4～5 d传代一次(图1)。

　　212诱导分化反向证明

　　未分化MSCs经成骨性诱导分化后，逐渐形成聚集体或小结，部分细胞胞浆内可见黑色物质存在，说明MSCs分化为成骨细胞。经脂肪分化诱导后三周形态学观察可见脂肪滴形成,此实验证明该细胞具有分化潜能，不是骨髓内的其他成熟细胞(图1)。& B. R: R; h0 \
0 v+ D7 U0 T7 P/ B5 `8 }
　　213MSCs流式细胞仪分析法/ Z, T/ r2 L% z- V5 X8 |

　　流式细胞分析结果显示， MSCs CD29、CD44阳性率分别为7293％和9132％，与平行对照组相比有明显差异 (P＜001),CD34、CD45为586％和688％，为非造血干细胞。表明上述分离细胞群同源性较高；为骨髓间充质干细胞(图2)。
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　　22不同因素对MSCs生长的影响% V3 w2 W5 s$ r7 C, H+ R+ B

　　221 相同接种密度不同换液时间对原代hMSCs数量的影响

　　以1106个 /cm2接种于24孔板，分别在接种后第2、3、4天首次换液，贴壁MSCs数量不同。2 d后换液贴壁细胞数量最少，约为10～30个/孔；第3天或第4天换液，贴壁细胞数量约30～50 个/孔。结果发现，首次换液时间在第3天时，贴壁细胞数量适中。
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　　222不同种植密度对原代、传代MSCs生长的影响: h& d- ~2 F9 |( `8 k6 o& g
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　　骨髓中MSCs含量很低，生长呈密度依赖性，低密度接种首次换液后，细胞数量太少，影响细胞间信息传递而使细胞增殖受限。本实验结果显示采用高密度接种培养(1106个/cm2)，可使MSCs尽可能完全贴壁，并且形成的细胞克隆大小能使细胞快速增殖。

　　223不同血清浓度对传代MSCs生长的影响
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　　本研究采用含8%～10黃与20黃的培养液。在接种密度(1106个 /cm2)和首次换液时间相同(第3天)的情况下，从接种开始，直至细胞汇流(24孔板每孔细胞长满)传出第1代所需要的时间定为P1day。此天数可说明原代培养细胞的增殖速率。经秩和检验分析显示(P＞005)，含8%～10黃的培养液，对MSCs生长最合适，而20黃未见加速其生长，并且细胞形态发生变化，同源性降低（见表1）。表1血清浓度与P1 day的关系（略）" |# G4 @% h, F! h1 i- p

　　3讨论) |; q0 l$ Q$ D" Y7 x3 C/ [
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目前关于MSCs的分离，国内外大多数实验室仍主要采用培养选择法(Culture selection)，即贴壁筛选法,但所获得的细胞同源性差，体外不能大量扩增。因此人们又将密度梯度离心法和贴壁筛选法结合，达到分离纯化MSCs的目的〔1～3〕。本实验采用Percoll分离剂（1073 g/ml），能有效分离纯化骨髓血中的单个核细胞层，从而使MSCs纯度增高。MSCs表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166等表面抗原〔4〕，不表达造血系统标志，包括CD14、CD34及白细胞共同抗原CD45。本实验通过流式细胞分析显示，90％以上的细胞表达MSCs相对特异性抗原CD44和CD29，说明所分离细胞群同源性较高；而CD34、CD45阴性，显示该细胞群纯度较高，为非造血干细胞。诱导分化反向证明，部分细胞经成骨性诱导后可分化为成骨细胞，经脂肪分化诱导后3 w形态学观察胞浆可见细小脂滴形成。反向诱导分化说明该细胞群为干细胞，具有分化潜能，不是骨髓内其他成熟细胞。以上结果通过正反两方面说明，分离的细胞群为MSCs。$ D/ ^1 ]0 A. P0 I! G+ T

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0 D: k& {) u+ b3 e& v9 }) H
间充质干细胞来源于中胚层,具有很强的自我复制能力和多向分化潜能,它分布于全身各结缔组织,尤以骨髓中含量最多。但即使是在骨髓中,MSCs的含量也很低，每105～106个单核细胞中大约含一个MSCs,并且随着增龄,MSCs含量逐渐减少〔5〕。本实验发现老龄兔MSCs相同密度接种首次换液时间过早，细胞数量太少，影响细胞间信息传递而使细胞增殖受限。另外，根据实验结果发现，首次换液时间在第3天时，MSCs贴壁细胞数量适中，并且形成的细胞克隆大小能使细胞快速增殖。因此本实验首次换液时间第3天为宜。同时观察到低密度接种传代培养不敏感，细胞扩增缓慢。传代培养同样，不采用高比例传代(1∶4)，因为此种方式易导致细胞失去密度依赖而发生死亡。采用低比例1∶2或1∶3传代，细胞增殖迅速并且同源性好。本实验研究显示采用高密度接种培养(1106个/cm2)效果好，老龄兔MSCs培养的密度依赖性，可能与种属或培养所用条件有关〔6，7〕。$ \$ `, B/ I( F2 F
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本实验采用8％～10％血清，此浓度足以维持MSCs生长，增加血清浓度(20％)并不加速细胞生长，反而促进分化，因为高浓度血清中含有大量有丝分裂原，可刺激细胞增殖分化。除此之外，所用培养液为低糖DMEM，适合生长慢贴壁好的细胞，其他一些细胞可能不适应低渗条件而逐渐死亡。但实验过程中发现血清浓度过低、细胞密度过大会造成细胞营养不良、脱落，无血清培养不适老龄MSCs。因此本实验采用的培养体系更有利于老龄供体MSCs的生长。这为体外大量扩增并保持未分化增殖状态，进一步应用和研究老龄MSCs奠定坚实的实验技术基础。
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吉林省科技厅资助课题（200505194）! v3 G- L) g( t5 s7 D
      【参考文献】
　　1 Kostenuik PJ,Halloran BP,MoreyHolton ER,et alSkeletal unloading inhabits the in vitro proliferationand differentiation of rat osteoprogenitor cells〔J〕Am J Physiol,1997,273(6Pt1)∶E1133+ {2 A2 y& [: ^

　　2 Lennen DP,Haynesworth SE,Young RG,et alA chemically defined medium supports in vitro proliferation and maintains the osteochondral potential of rat marrow derived mesenchymal stem cells〔J〕Exp Cell Res,1995;219(1)∶211

! k8 h, F% g6 T6 X: c& `  @
　　3 Maniatopoulos C,Sodek J,Melcher AHBone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats〔J〕Cell Tissue Res,1988;254(2)∶317

9 b- D- g3 j0 p$ ]4 L6 ^

　　4 Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC,et alMultilineage potential of adult human mesenchymal stem cells〔J〕Science，1999;284(5411):14378 K. X0 N/ M  U' F% w

6 U% S0 A3 l' W, l
　　5 Ohgushi H,Calplan AIStem cell techonology and biocramics：from cell to gene engineering〔J〕J Biomed Mater Res,1999;48(6)∶913
2 l* b# i/ a  h4 p5 h! v" Y
- P4 u4 t1 G- T5 [) t$ r% ^

　　6 Bruder SP，Jaiswal N，Haynesworth SEGrowth kinetic，selfrenewal，and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation〔J〕J Cell Biochem，1997;64(2):27894
$ U/ j" _; C( h3 H8 I" x) q

　　7  Javazon EH，Colter DC，Schwarz EJ,et alRat marrow stromal cells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from singlecellderived colonies than human marrow stromal cells〔J〕Stem Cells，2001;19(3):21925

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