大鼠胎血间充质干细胞移植对局灶性脑缺血治疗作用的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:25 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：鞠秀丽作者单位：山东大学齐鲁医院儿科，山东济南 250012




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      【摘要】  目的：研究大鼠胎血间充质干细胞(MSCs)移植入大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型后大鼠神经功能的恢复情况。方法:线栓法建立左侧大鼠MCAO模型,随机分为3组:手术组、MSCs 移植组、生理盐水组。5溴2脱氧尿核苷(BrdU) 标记的MSCs移植后，采用改良神经功能损伤评分系统(mNSS)评价大鼠神经功能恢复情况；应用免疫组织化学双染技术检测MSCs的存活、迁移及其巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。结果:MSCs增殖能力强，并能在体外诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。MSCs移植后显著提高局灶性脑缺血大鼠神经功能的恢复。移植的MSCs细胞可在大鼠脑组织中存活,并向缺血区域迁移, 有不同比例MSCs 细胞分别表达Nestin、 GFAP、NSE。结论:大鼠胎血中含有MSCs，体外扩增纯化后可促进局灶性脑缺血大鼠神经功能的恢复,移植细胞可在大鼠脑缺血区域中存活、迁移并向星形胶质细胞或神经元分化。 * H+ b  _+ d+ x: q  L4 G, H5 }& R) F7 ~
      【关键词】胎血干细胞缺氧缺血脑移植大鼠 Wistar
   ATransplantationof fetal bloodderived mesenchymal stem cells+ @' l% t* N8 @5 T9 Q5 Y0 S
7 O0 `0 v  O) a
in the treatment of cerebral ischemia in rats
* `/ ~" X5 _/ f1 d' G% G. c2 g
JU Xiuli1, HUANG Zhiwei1, WEI Xinbing2, HOU Huaishui3, SHI Qing3, LI Dong3, SUN Nianzheng1
" |; L  ]+ O: f$ E& ^
(1. Department of Pediatrics, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China;

2. Department of Parmacology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China;& \' r- X3 c& b( y# E

3.Cryomedicine Laboratory, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China)
- i$ P0 ?4 u. G7 J; A
［ABSTRACT］Objective: To observe the role of purified mesenchymal stem cells (MSCs) derived fromfetal blood on the neurological function in rats with middle cerebral artery occlusion (MCAO). Methods: Thirty adult maleWistar rats were randomly divided into three groups: the operation group,the transplantation of MSCs group and the injection of saline group. Functional outcome measurements were performed based on the modified neurological severity score(mNSS) at day 1, 7, 14, 21 and 28 after MACO. The survival, migration,expression of Nestin, glial fibriliary acidic protein (GFAP) and neuronspecific enolase(NSE) of 5bromo2deoxyuridine（BrdU）labeled MSCs were detected byimmunohistochemical double staining. Results: MSCs from the fetal blood had a powerful proliferation ability.MSCs significantly improved theneurological function (P5 n$ B; L8 t. N- r" k' w! A

［KEY WORDS］Fetal blood；　Stem cells；　Hypoxiaischemia, brain； Transplantation；Rats, wistar间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一群具有自我更新、多分化潜能的非造血干细胞，从人骨髓、外周血、肌肉、胎肝、脐血中分离获得,可分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、神经元［1］。许多动物实验已证明MSCs在骨折愈合、腱修复、软骨再生及对神经系统疾病、肝衰竭、心肌损伤等的治疗有临床应用价值。有报道采用骨髓MSCs移植治疗大鼠脑缺血损伤不仅可以缩小梗死灶体积，还可改善大鼠缺血症状，但多经脑室注入、颈动脉注射［2］，限制了临床应用。我们在前期实验中已建立了对大鼠胎血MSCs的分离、培养与诱导分化［3］，本研究通过经尾静脉注射MSCs给大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）大鼠，探讨其在脑内存活、迁徙、分化情况及其对神经功能改善的可能作用，使干细胞治疗为更多的脑缺血患者服务。6 [: n# y- I' t. ]; _: F7 ~

1材料与方法# X9 r$ u$ R, Z! A9 V. ~

1.1材料健康成年Wistar雄鼠30只、孕20?d大鼠15只均由山东大学实验动物中心提供；DMED/LG培养液、胎牛血清（FBS）系Gibco公司产；小鼠抗大鼠的CD11bFITC、CD44FITC、 CD54FITC、 CD45FITC抗体及小鼠IgG1FITC由SEROTEC公司提供;兔抗大鼠GFAP、Nestin、NSE抗体、小鼠抗大鼠5溴2脱氧尿核苷（5bromo2deoxyuridine, BrDU）系Boster公司生产；免疫组织化学双染试剂盒由北京中山生物技术公司提供。

1.2方法9 u, A% _# ~( P7 }5 H- o

1.2.1动物分组采用雄性Wistar大鼠30只，270 300?g。随机分为3组，每组10只： ①手术组为单纯建立大鼠左侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型；②MSCs移植组为左侧MCAO后24?h 移植，每只大鼠6106个MSCs;③生理盐水组为左侧MCAO后24?h注射等量生理盐水。
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1.2.2胎血MSCs的分离、培养、鉴定孕20?d大鼠剖腹取胎鼠，剪断颈部吸取断面血液，剪开胸腔抽取心脏中血液至含肝素30?U/ml的DMEM/LG培养液中。密度梯度离心法收获单个核细胞， PBS洗涤2次，按1105个/cm2的细胞密度接种于培养瓶中，培养液为含10鸖、青霉素100?U/ml、链霉素100?μg/ml的DMEM/LG，将培养瓶置于37?℃、5%饱和湿度的CO2培养箱中培养。1周后首次换液，每周换液2次,传代培养。取第5代MSCs，制成浓度为1106个/ml的单细胞悬液。分别加入10?μl小鼠抗大鼠CD11bFITC、CD44FITC、 CD54FITC、 CD45FITC单抗及阴性对照IgG。避光室温孵育20?min，PBS洗涤，流式细胞仪检测。取第5代MSCs，在一定的诱导条件下［4］，检测MSCs分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力。

1.2.3BrdU的标记及标记率的检测取5 7代细胞, 移植前72?h加入BrdU 20?μmol/L 进行标记。取已标记的细胞制备悬液密度为1106个/ml，加入胞膜打孔剂，避光30?min，加入小鼠抗大鼠BrdU单抗避光30?min，洗涤后滴加人抗小鼠IgGFITC避光30?min后，流式细胞仪检测。, a0 v1 x1 F) k% k
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1.2.4移植前MSCs活力检测制备单个细胞悬液密度为1106个/ml，1滴0.4%台盼蓝与9滴细胞悬液混匀，30?min内计数300个细胞，未着色者为活细胞，着蓝色者为死细胞。9 d+ }# C: l! Y% J8 n6 U
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1.2.5MCAO模型制作和细胞移植3％戊巴比妥钠按30?mg/kg腹腔注射大鼠麻醉后，颈部正中切口逐层解剖，分离左侧颈总动脉，在距颈内、外动脉分叉0.5?cm处结扎颈总动脉，结扎颈外动脉起始部，血管钳夹注颈内动脉，颈总动脉近端剪一小口，将前端烧成圆头的直径0.18?mm渔线插入颈内动脉，插入线长约17 22?mm时感到有阻挡感即停止，结扎颈总动脉根部以固定栓线，逐层缝合。栓塞1?h后将栓线拔出。栓塞24?h后移植组通过尾静脉每只大鼠注射含6106个MSCs的生理盐水1?ml；生理盐水组注射等量生理盐水；手术组不作任何处理。* n& v, g  U% |
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1.2.6行为学评价手术后1、7、14、21、28?d采用改良神经功能损伤评分(modified neurological severity score mNSS)对动物进行行为学检查［5］。mNSS总分为18分,1 6分为轻度伤害,7 12分为中度伤害,13 18分为重度伤害。1 z7 h1 G& r, N! F, p. ~

1.2.7组织学和免疫组织化学双染移植后7、14、21、28?d各组分别随机采用40?g/L 多聚甲醛法灌注大鼠,取肝、脾、肾石蜡切片，常规HE染色，观察有无免疫排斥反应。取前囟前后1?mm的脑组织,石蜡包埋,连续切为厚6?μm冠状切片,进行HE染色和免疫组织化学染色。固定后破膜,血清封闭,抗BrdU单克隆抗体(1∶100) 4?℃孵育过夜,通用型生物素化二抗(1∶100) 室温10?min,滴加链霉卵白素－碱磷酶轭合物孵育10?min，碱磷酶底物－色素混合液显色,滴加双染增强剂30?min,加抗Nesin、NSE、GFAP抗体（1∶100）孵育过夜，生物素化二抗，过氧化物酶标记链霉卵白素孵育10?min，过氧化物酶底物－色素混合物显色，HistomountTM封片剂封片。记数双标记细胞占BrdU 阳性细胞的百分数。

1.3统计学处理数据以均数±标准差(±s)表示,采用双侧t检验。4 f  s2 h4 R* V. K8 R: v* {

2结果5 u9 ?* k4 Y4 z" l; }; R2 A+ x+ F

2.1胎血MSCs的培养与鉴定胎血单个核细胞原代培养2?d后有贴壁细胞长出。随数量逐渐增多呈纤维样束状排列，也有少量圆形细胞散在。大约2周时细胞达70% 80%融合首次传代。从第3代后，镜下观察视野中为形态均一的梭形MSCs，见图1。MSCs增殖1代约需4 8?d，8代以内保持较快增长速度。流式细胞仪检测结果显示胎血MSCs表达抗原标记CD54 、CD44分别为82.3％、79.1％,不表达CD11b、CD45。在适当的条件下，大鼠胎血MSCs可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞，见图2、图3。
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2.2BrdU标记率及活力检测移植前MSCs经流式细胞仪检测，BrdU阳性率为93％。台盼蓝排斥实验检测MSCs活细胞率是97.8％。

2.3行为学评价MCAO后大鼠均出现右侧肢体肌力减退,行走歪斜、倾倒且不能直线行走,平衡能力明显减弱。大鼠脑缺血再灌注后1?d和7?d,各组动物的mNSS评分差异无统计学意义。移植后14?d到第28?d,各组动物神经功能均有不同程度恢复,其中MSC细胞移植组神经功能恢复明显优于另两组,mNSS评分比较差异有统计学意义，见图4。' p7 s" ?6 ^% |. o4 }  }
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The modified neurological severity score (mNSS) after UCB MSCs transplantation2.4组织学与免疫组织化学染色
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2.4.1HE染色镜下观察肝、肾、脾细胞形态无明显异常，无免疫排斥反应。脑组织手术组和生理盐水组左侧大脑皮层背外侧、尾壳核、下丘脑的背外侧镜下见大量神经细胞变性、坏死,胞体皱缩,核固缩,碎裂,溶解,胞浆浓缩红染,间质水肿明显,炎症细胞浸润；MSC 移植组神经细胞变性、坏死数量与程度明显减轻。
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2.4.2免疫组织化学双染从细胞移植后14?d开始，在MSCs移植组左侧基底节区、尾壳核、纹状体及背外侧皮层下可见蓝紫色的BrdU 阳性移植细胞,部分细胞分别表达猩红色的巢蛋白（nestin），见图5。神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase, NSE），见图6。神经胶原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP），见图7。且随移植时间的延长,双标记阳性细胞数目逐渐增多,28?d时BrdUGFAP双标记阳性细胞比率为(5.24 ±1.06)%,BrdUnestin 双标记阳性细胞比率为(2.88±0.76) %，BrdUNSE双标记阳性细胞比率为(1.34±1.29)%。

　　3讨论 ) y: Z0 q3 P6 X, A
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近些年，众多学者的研究表明人脐血中存在MSCs，表达与骨髓MSCs相同的细胞表面标志如SH2、SH3、SH4及其他整合素、基质受体，在适宜条件下，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞甚至非中胚层的神经胶质样细胞、肝细胞样细胞诱导分化。在本研究中,我们成功地从大鼠胎血中分离获得MSCs,形态呈成纤维细胞样的细胞群体,增殖速度较快,随传代的增加,逐渐获得单一的MSCs。免疫表型检测显示CD54、CD44阳性表达, 不表达CD11b、CD45,与骨髓来源MSCs相似［6］。8 g8 J. O& n4 Y9 _! K
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本研究经尾静脉移植胎血MSCs到局灶性脑缺血的大鼠体内，明显地改善了神经功能的恢复，提示MSCs可透过血脑屏障进入脑组织，具有神经保护作用,这为MSCs治疗缺血性脑血管病提供了行为学上的实验证据。BrdU在细胞S 期可以标记DNA作为示踪,免疫组织化学双染法主要在缺血侧的脑组织发现存活的BrdU标记MSCs而在健侧几乎未发现。这说明受损后血脑屏障通透性增加，许多正常情况下不能或很少透过的物质就可以自由进入脑实质。大约5％BrdU阳性细胞表达GFAP，大约2% BrdU阳性细胞表达nestin, 大约1%BrdU阳性细胞表达NSE,表明植入后的MSCs能向神经干细胞、星型胶质细胞、神经元分化。这与应用骨髓间质干细胞移植实验结果类似［2］。$ j! }/ L* V/ ~9 \* g% b2 Q
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MSCs促经脑缺血再灌注损伤功能恢复的机制。我们认为: ①作为干细胞, MSCs可能在局部微环境的刺激下分化神经元样细胞和神经胶质样细胞,替代发生坏死和凋亡的神经细胞,从而起到脑保护作用［6］,但是文献报道的分化比率较低,而且这些神经样细胞是否真正具备神经细胞功能也有待研究； ②MSCs激活了存在于室管膜下区的神经干细胞(nerve stem cell,NSC)［8］,被激活的内源性NSC进一步定向分化为神经细胞,起到脑保护作用；③可能与干细胞通过自分泌的形式产生各种细胞因子有关［9］。研究证实, MSCs能分泌IL6、IL11、TPO、SCF、FLT3及LIF等多种细胞因子, 也可促进神经细胞分泌NGF、VEGF、HGF等［10］,细胞因子作为一种细胞传递信号,可以调节细胞的增殖与分化,并对神经细胞起到支持营养作用,限制神经损伤的范围和促进功能恢复。另外，MSCs表达的多种细胞因子受体IL1R、IL2R、IL3R、TNFαR，与受损脑组织释放的化学物质及损伤激活细胞分泌的一系列生物活性因子相互作用，促进了MSCs向病灶迁移。, e# g1 T' v9 X
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本实验证实大鼠胎血MSCs具有扩增能力强、方便易得、无免疫排斥等特点,进行移植治疗局灶性脑缺血,已显示其可行性且疗效明显,为脐血MSCs治疗脑缺血提供了实验依据。但如何控制调节MSCs进入脑实质定居至病灶的生物学行为、如何促进MSCs增殖分化为神经细胞的效率以发挥更强的治疗作用等问题有待我们进行更深入的研究。* b- Q7 U, h5 j( b* z5 \
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