血管内皮细胞作为饲养层细胞对胚胎干细胞的生长支持作用 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:24 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：王志华，何志旭，米蔷，汪浩文作者单位：贵阳医学院干细胞研究中心，贵州贵阳  550004；贵阳医学院附院儿科，贵州贵阳  550004
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      【摘要】  　　目的：探讨人脐静脉血管内皮细胞是否可作为饲养层来支持胚胎干细胞的生长，并维持其未分化状态。方法：使用健康产妇剖宫产后遗弃的脐带培养内皮细胞，并进行细胞传代培养和增殖扩增。将脱离饲养层克隆生长良好的E14.1胚胎干细胞接种到经丝裂霉素C（10 mg/L）灭活后的2～5代内皮细胞饲养层上进行传代培养，对培养的胚胎干细胞进行碱性磷酸酶、Oct-4及体内全能分化实验鉴定。结果： E14.1胚胎干细胞在人脐静脉内皮细胞上传3～8代后能较好地保持未分化状态，高度表达碱性磷酸酶及干细胞因子Oct-4；体内全能分化实验显示，在内皮细胞上生长6代和10代以上的E14.1胚胎干细胞被接种到裸鼠6周后，形成含三个胚层的组织细胞畸胎瘤。结论：（1）人脐静脉血管内皮细胞可作为饲养层支持胚胎干细胞的生长；（2）胚胎干细胞在内皮细胞上能保持未分化状态；（3）人脐静脉血管内皮细胞可以作为一种来源丰富，取材方便的人源化饲养层细胞新来源，为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础。
      【关键词】干细胞；脐静脉；人；内皮，血管
   　　The Growth Support Effect of Vascular Endothelial Cell as

Feeder Layers to Human Embryonic Stem Eells1 Z3 R3 J5 B8 o4 S7 u; N# b. M9 `
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　　WANG Zhihua, HE Zhixu, MI Qiang, WANG Haowen
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　　(Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang550004, China, and The Research Center for Stem Cells, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)5 Z) p' _' H" F" e% B' s
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　　［Abstract］ Objective: To explore whether umbilical vein endothelial cell (EC) can be used as feeder layers to support the growth of embryonic stem cells (ESC) and to retain their un-differentiation status. Methods: The abandoned umbilical cords were collected from healthy puerpera, and ECs were cultured and proliferated under asepsis condition. The morphologic characteristics of the cells were observed with inverted microscope and factor Ⅷ antigen was identified by using immunochemical method. The cultured cells from the second to the fifth generations were deactivated by treatment of mitomycin-C (10ug/ml) for 30～60 minutes, before E14.1 ESC colonies that isolated from feeder layer and were in good state were seeded on to them. The indexes used to indicate the living and differentiation state of the ESCs included alkaline phosphatase (AKP) activity, transcription factor Oct-4 expression, and the in vivo omnipotence test on the hind leg of nude mouse. Results: E14.1 ESCs formed good colonies, retained undifferentiated state and highly expressed a membrane alkaline phosphatase and a high level of Oct-4 when they were cultured and passed for 3~8 passages on human umbilical vein ECs. The E14.1 ESCs cultured on ECs for more than 6 passages and 10 passages formed teratomas containing three embryonic layers in 6 weeks after being inoculated into the hind leg of nude mice. Conclusions: ECs from allantoic veins can be used as feeder cells to support growth of ESCs. ESCs cultured on ECs can keep their undifferentiated characterization. Human umbilical vein ECs might become a rich source of feeder layers. The results of this study would lay a base for future clinical application.& e0 m1 H5 t; H+ I* ]; P0 q

　　［Key words］ stem cell; umbilical vein; persons; endothelium,vascular

胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES）是由早期内细胞团或原始生殖细胞经体外分离、抑制分化培养获得的多潜能细胞，能在体外反复增殖培养并长期维持正常核型并高表达Oct-4基因和碱性磷酸酶细胞（alkaline phosphatase, AKP）[1,2]，ES能在体内外分化为三个胚层的组织细胞，是人体组织工程重要的“种子”细胞。1998年，Thomson[1]首次报道建立人的ES细胞系，为ES细胞的临床应用展现了曙光。目前人ES细胞大都以小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEFs）作为饲养层来支持ES细胞的生长，但是小鼠来源的MEFs存在异种蛋白或者携带致病病毒等危险，从而限制了在临床的应用。最近的研究显示，血管内皮细胞（endothelial cell, EC）能释放可溶性因子，刺激中枢神经干细胞的自我更新，并保持神经源性的潜能[3]。2007年，以人脐静脉血管内皮细胞作为饲养层，研究其对胚胎干细胞生长的支持作用，探索一种来源方便、取材于人类组织细胞制备饲养层的新方法，促进胚胎干细胞的临床应用。6 k5 x5 N: W5 X8 |  y# c5 m: o

　　1材料与方法8 s+ R) K+ B  n6 [1 F1 b
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　　1.1材料

　　采自贵阳医学院附院健康产妇分娩后遗弃的脐带，经患者知情同意和医学伦理委员会批准；小鼠E14.1胚胎细胞株由中山医科大学干细胞中心提供，裸小鼠购自上海动物实验中心，小鼠胚胎成纤维细胞由贵阳医学院免疫学教研室提供；; O/ `! A& v1 {- M9 {9 L
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　　1.2试剂与培养
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　　基高糖DMEM培养基：Gibco公司；胎牛血清：Hyclon公司；谷氨酰胺：Amresco公司；非必需氨基酸、β-巯基乙醇及丙酮酸钠是Sigma公司产品；碱性磷酸酶试剂盒：南京建成生物公司；Trizol试剂盒：上海生工生物工程技术服务有限公司；RT-PCR试剂盒：TaKaRa公司；引物序列：由TaKaRa公司合成；100 bp DNA Ladder Marker：TaKaRa公司( r) B# m; U+ x" W
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　　1.3方法" U9 A+ G# [# v5 Q9 h

　　1.3.1人脐静脉内皮细胞的培养、鉴定及饲养层的制备

　　取产后6 h内的健康产妇分娩后遗弃的脐带，人脐静脉内皮细胞培养按照文献[4]的方法加以改进。取第2~3代人脐静脉内皮细胞作为饲养层。将EC以1105/ml密度接种在预铺有1.5%明胶的培养皿，当细胞长成单层，加丝裂霉素C （mitomycin-C） 10 mg/L，37 ℃，5%CO2培养箱培养，30~60 min后用PBS洗5次，换低糖DMEM培养液，放在37oC，5%CO2培养箱中培养备用。6 L* W! g! _6 [& W: ~( e* ], }# O

　　1.3.2ES在内皮细胞饲养层上生长及传代' v8 ^: s- l' U- P' v

　　常规复苏ES细胞，以5105/ml细胞密度接种在预铺有2%明胶的6孔培养板中培养，待细胞形成完整克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化ES细胞，然后接种到经过丝裂霉素C处理后的EC饲养层上，加入ES培养液，放入CO2培养箱（37 ℃，5%CO2），24 h换液1次，待ES细胞克隆生长较密集后，消化传代接种在新的EC饲养层上，并按此法连续传代。

　　1.3ES生物学特性鉴定

　　1.3.1碱性磷酸酶染色

　　采用重氮盐方法检测，在6孔塑料培养板内放置无菌的盖玻片，待EC生长至融合，经丝裂霉素C处理后接种生长在EC饲养层上传3代和8代的ES细胞，待ES克隆生长良好后，弃培养液，用蒸馏水洗三遍，晾干，加固定液固定5-10分钟，用蒸馏水洗三遍，晾干，按照说明书顺序操作，最后中性树胶封片，镜下观察染色结果并摄片。# N0 q2 Y( M3 X0 `  s$ p

　　1.3.2Oct-4的检测

　　按照RT-PCR试剂盒说明书，采用两步法，引物的设计参照以往的文献[5] ，同时以鼠β-actin作为内参照，提取在EC饲养层上传3代、8代的ES细胞总RNA，先合成cDNA，然后再进行PCR反应，反应结束后，取PCR反应液5 μl在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶图像分析系统进行处理。鼠Oct-4引物(302 bp)：forward 5-GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3,reverse 5'-CTCGAACCACATCCTTCTCT-3'。鼠β-actin作为内参照（530 bp）：forward 5'-CCCACACTGT-GCCCATCTAC-3'，reverse 5'-AGTACTTGCGCT-CAGGAGGA-3'。
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　　1.3.3ES的体内全能分化实验

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　　取2只8～10周龄、体重18～22g的雄性裸小鼠，在小鼠右后腿内侧接种在内皮细胞上连续传6代、10代后的ES细胞悬液0.3ml，细胞浓度为2.5106/ml，以相同细胞浓度的内皮细胞接种在小鼠左前腿内侧皮下作为对照。观察6周，于第6周末处死小鼠，观察接种部位有无肿瘤形成，摘取瘤体，测量肿瘤大小，并行常规组织病理学检查。

　　2结果
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　　2.1人脐静脉内皮细胞人脐静脉内皮细胞原代培养时，显微镜下观察最初细胞是圆形、椭圆形及成团块状，仅有少数细胞伸展， 48~72 h细胞生长最快，变成梭形；7~10 d后细胞融合，传代细胞分布较均匀，内皮细胞成单层生长，形态成多角形，鹅卵石状镶嵌排列，边界清楚，胞浆丰富，胞核呈圆形或椭圆形，偶见双核，一般生长3~5 d融合成片。此外将培养的细胞通过免疫组织化学法进行Ⅷ因子相关抗原检测证明是内皮细胞（图1，图2）。

　　2.2生长在内皮细胞饲养层上的ES细胞ES接种在内皮细胞饲养层上，一般在24 h后，最迟在48 h后即出现的克隆。克隆成椭圆形或圆形，克隆内的细胞也紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞内有一个大的核，核内可见1~2个核仁，胞质较少。细胞间界限不清, 但克隆周边与饲养细胞层分界清楚，无分化迹象。与生长在小鼠MEFs上的形态相似，在内皮细胞上的ES克隆一旦出现，可快速生长。表现为克隆逐渐增大，中央逐渐隆起，一般在1~2 d后饲养层上可布满大量的克隆，此时需要传代培养，否则胚胎干细胞易从饲养层上脱落或分化（图3、图4）。
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　　2.3碱性磷酸酶染色ES细胞在EC上传3代和8代后分别进行AKP染色，结果表明在EC上培养的ES同在MEFs的ES细胞一样都被染成深蓝紫色，而周边的饲养层没有被染上深蓝紫色（图5、图6）。1 }1 \5 R, v+ q9 f$ V

　　2.4Oct-4检测文献[5]指出Oct-4为302 bp；β-actin为530 bp，由图7可见1、2、3、4泳道均出现β-actin530 bp分子量条带，而仅来源于饲养层上的ES细胞才出现302 bp大小的 Oct-4基因。

　　2.5畸胎瘤形成及组织分化情况将在内皮细胞上连续传6代和10代的ES细胞和内皮细胞接种裸小鼠后的第7天，可见接种部位皮肤隆起，可扪及黄豆大小、柔软的包块，其后包块呈进行性增大，而接种内皮细胞的部位未见皮肤隆起和包块形成；第6周末处死小鼠，解剖中见ES细胞接种部位皮下巨大的畸胎瘤形成，包膜完整，与周围组织无明显粘连，摘除肿瘤测量其体积，分别为3.0 cm2.8 cm3.1 cm、3.1 cm3.6 cm3.3 cm。组织学检查显示肿瘤内含有3个胚层的组织结构，如外胚层的毛囊、神经纤维、皮脂腺；中胚层的横纹肌、血管、软骨；内胚层的黏膜上皮、腺上皮以及纤毛柱状上皮，证实为畸胎瘤（图8）。! F3 I( L+ m5 C3 L" S
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　　3讨论　　

　　随着人类ES细胞体外分离培养和建系成功，由ES细胞做为“种子”细胞来源的组织工程产品和细胞替代治疗，为临床治疗某些疾病提供了可能性。但是目前成功建立的人类ES细胞系均有小鼠MEF来源的细胞作饲养层，这就为ES细胞的临床应用造成了障碍，人们不得不为其生物安全性担忧。要解决这个问题可以从两个方面着手：（1）建立不含饲养层的ES细胞培养体系；（2）使用人类自身来源的组织细胞建立饲养层系统。小鼠ES细胞在不含饲养层的培养体系中可以在一定时间内较好地维持生长和保持胚胎干细胞特性，但是人类ES细胞在脱离饲养层后极易发生分化，同时细胞生长增殖缓慢，传代扩增困难，目前尚无理想的不含饲养层的人类ES细胞培养体系开发出来。相对来说，采用人类组织细胞替代MEFs 开发支持人类ES细胞的培养生长体系较易实现，目前这方面的研究已有了一些进展。部分研究者已成功使用人胎儿肌肉成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞、成人输卵管上皮细胞、人骨髓基质细胞做为饲养层在体外支持人类ES细胞的生长[6，7]。这类研究虽然初步回答了人类组织细胞来源的饲养层建立的可能性问题，但是实施起来有一定困难，其来源均非常不易，且受到伦理学限制。因此，开发一种来源方便，更加便捷、实用的人组织细胞饲养层技术，就成为一个迫切需要解决的问题。　　+ F) z: I% x4 i9 ?0 v8 J# f

　　以人脐静脉血管内皮细胞作为饲养细胞，它具有以下优点：(1)相对于人体其它的组织器官来说，胎儿脐带来源较方便；(2)在体外扩增能获得较多的细胞。目前血管内皮细胞培养技术较成熟，大量实验资料证实内皮细胞可在体外大规模扩增，有资料显示内皮细胞在体外最高传代次数可达36代，这为饲养层的制备提供了极大的方便。如果采用相关技术，延长内皮细胞的端粒长度，有可能使内皮细胞实现永生化的目标，将提供源源不断的细胞来源。但是内皮细胞能否做为饲养层细胞最关键一点是它能否分泌ES细胞生长和保持未分化的关键生物因子。近期Qin Shen等[3]研究发现血管内皮细胞能释放某些可溶性生长因子支持中枢神经干细胞的自我更新，并保持其干细胞的潜能，提示内皮细胞有可能做为饲养层，具有支持ES细胞生长的功能。　　

　　正是基于上述理由，本研究采用人脐血管内皮细胞建立ES细胞饲养层获得成功。对于ES细胞饲养层处理时间，以往的文献报道是用丝裂霉素C处理2.5 h[2,8]，本实验按此时间处理内皮细胞，发现在处理后24 h，内皮细胞脱落的较多，而我们用30~60 min处理内皮细胞，内皮细胞脱落的较少且在上面接种ES细胞后ES细胞生长较好，使用不同传代次数的内皮细胞作为饲养细胞，它们都可以支持胚胎干细胞的生长，但以第2代和第3代的较好。胚胎干细胞株E14.1细胞在内皮细胞饲养层上连续传代后细胞圆形或椭圆形克隆状形态完整，AKP染色呈阳性反应，并且检测出干细胞特异性因子Oct-4基因的表达。Oct-4是ES细胞保持未分化状态的标志，在胚胎干细胞状态时转录最强，一旦ES细胞出现分化，其表达即消失。通过检测在EC上传3代、8代的ES细胞的AKP，发现在EC上的ES细胞，和在MEFs上的ES细胞一样，表现了相同的细胞形态，而且都高表达AKP。 Oct-4是POU家族的转录因子，Oct-4基因所表达的蛋白是一个细胞全能性的标志[1]，也是维持细胞多能性的一个重要转录因子。David CH等[5]在人ES细胞系和鼠ES细胞系中，通过下调Oct-4基因，发现下调Oct-4可导致这两个ES系的胚胎干性降低，而在细胞形态和分子水平上的分化性增加，Niwa等[9]也认为Oct-4基因与ES细胞分化密切相关。最近Tom Burdon等[10]报道，通过下调转录因子Oct-4，在人与鼠ES细胞中能产生相似的内胚层和饲养层分化标志物模型，如内胚层相关基因Gata6表达增高、饲养层相关转录因子Cdx2表达增高，因此Oct-4是人与鼠ES细胞的特异性表面标志物，可作为ES细胞鉴定的指标之一。本实验使用在EC上培养传了3代、8代的ES细胞，通过RT-PCR方法检测到Oct-4基因。将在EC上传了6代和10代的ES细胞接种到裸小鼠体内，在接种后1周发现裸小鼠接种部位出现肿块，且随着时间增加，肿物逐渐增大。6周后解剖SCID小鼠做病理切片发现：肿瘤内含有3个胚层的组织结构，如软骨、黏膜上皮、神经纤维、毛囊、皮脂腺、横纹肌、骨骼和肺泡上皮等，证实为畸胎瘤。表明人脐静脉血管内皮细胞能够支持胚胎干细胞的生长并保持其未分化状态。

　　人的胚胎干细胞必需要有饲养层细胞才能保持未分化状态，饲养层细胞的作用是提供ES细胞贴壁生长的环境和信号，并分泌多种细胞因子抑制ES细胞的分化并促进其增殖。目前已经证明内皮细胞可以分泌多种细胞因子[11、12]，如造血刺激因子，造血抑制因子以及细胞黏附分子。内皮细胞自分泌LIF和多种细胞因子，其中LIF能单独或与IL-6，GM-CSF，G-CSF协同抑制正常胚胎干细胞的定向分化，这可能是内皮细胞能支持胚胎干细胞生长的重要因素之一，所以它能促进ES细胞的生长及增殖并保持ES细胞的未分化状态，因此内皮细胞也可作为胚胎干细胞饲养层的一种细胞，支持胚胎干细胞的生长。: t; j4 d1 w5 ^1 S
      【参考文献】5 T0 n* N9 R' t" r" o4 r
　　[1]Thomson JA, Itskoritz-Eldor J, Shaoiro SS, Waknitz MA, et al. Embryonic stem cell lines derived from humanblastocysts[J]. Science, 1998(5391):1145-1147.
3 c" G% B- V* m1 ?$ M; V3 y

　　[2]Reubinoff BE, Pera MF, Fong C et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro[J]. Nat Biotechnol, 2000(4):399-404.6 B: I; {2 e( G4 ^, X, v
, ^; m/ y, l4 t/ _0 C% a. C

) n9 m3 W. A. `7 M3 \
　　[3]Qin Shen, Susan KG, Li Jin, et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells[J]. Science, 2004(5673):1338-1340.
' j7 G" W1 N* Q: H4 G; s
# T) g$ W  Q5 a) u, H0 r, c

　　[4]牛青霞, 何韶衡, 陈韩秋. 人脐静脉内皮细胞的体外培养与鉴定新方法探索[J]. 汕头大学医学院学报, 2005(18):5-7.! p8 v$ m9 h) i
/ m- Q8 r+ M7 [3 k
+ W; l. J% `9 o& @6 n
! J6 t' S8 P8 x* J+ q+ ^* W
　　[5]David C. Hay, Linda Sutherland, John Clark, et al. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells[J]. Stem Cells, 2004(2):225-235.
) p, c( L# \- b& O; H+ i/ h
  r$ @4 R  u3 P+ p3 t

　　[6]Richards M, Fong CY, Chan WK, et al. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells[J]. Nat Biotechnol, 2002(9):933-936.
* j. ]* }$ R+ n* w' r# J( D

　　[7]Cheng L, Hammond H, Ye Z, et al. Human adult marrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cell in culture[J]. Stem Cells, 2003(2):131-142.

　　[8]Suemori H, Tada T, Torii R, et al. Establishment of embryonic stem cell lines from cynomolgus monkey blastocysts produced by IVF or ICSI[J]. Dev Dyn, 2001(2):273-279.

% {9 Y6 F+ ?; O' I8 R
　　[9]Niwa H, Miyazaki J, Smith AG.. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiations or self-renewal of ES cells[J]. Mol Cell Biol.2002(5):1526-1536.

9 S0 P$ K5 Z( F7 h
　　[10]Tom Burdon, Davidc Hay, Linda Sutherland et al. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells[J]. Stem Cells, 2004(2):225-235.

1 H) b& V5 O- w% p: r/ I- t
　　[11]Guha Krishnaswamy, Jim Kelley, Lakshm Inarayanyerra, et al. Human endothelium  source of multifunctional cytokines: molecular regulation and impossible role in human disease[J]. Interferon and Cytokine Res, 1999(1):91-96." t; C2 U# ~; M& c" @4 I

& {/ C: t, D; x6 b- _4 T# z5 J

　　[12]Broudy VC, Kaushansky K, Harlan JM et al. Interleukin 1 stimulates human endothelial cells to produce granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and granulocyte colony-stimulating factor[J]. J Immunol, 1997(2):464-468.

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