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作者：姜横滨 韩剑锋 方波作者单位：黑龙江省齐齐哈尔市公安医院骨科 % B A# V$ @, x2 M- V
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【摘要】 目的 探讨人肌源性干细胞（MDSCs）的分离、培养、鉴定及体外成骨作用，为临床应用提供实验依据。方法 采用消化法分离MDSCs，应用差速贴壁法纯化干细胞，免疫细胞化学染色对细胞鉴定，MDSCs在骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导分化后，检测其碱性磷酸酶、骨钙素。结果 成功获得高纯度的MDSCs，免疫组织化学方法能够有效鉴定MDSCs，BMP-2诱导MDSCs后能够合成碱性磷酸酶、骨钙素。结论 可通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，其具有干细胞特征，并能够转化为骨系细胞，发挥成骨作用，为组织工程的临床应用提供种子细胞。
4 D+ _' s0 S. b" a 【关键词】肌源性干细胞 原代培养 诱导成骨
- N. v# f- @1 @+ i. c5 z 肌源性干细胞（muscle derived stem cells, MDSCs）是一种成体多能干细胞，已成为基因治疗和细胞介导的组织工程领域内的研究热点。其具有多项分化潜能和自我更新能力，且来源丰富、取材容易、扩增迅速。本研究旨在探讨MDSCs分离、培养、鉴定方法，并验证其体外向骨系细胞转化的成骨能力，为将来临床应用在体内促进骨骼愈合奠定基础。# J( ?3 A# E5 V6 O# \
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1材料和方法/ k' z: R1 x/ Y( p j$ O
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1.1主要试剂Ⅺ型胶原酶、胰酶、多聚赖氨酸(Sigma公司)；兔抗人Dismin单克隆抗体、Sca-1抗体（PharMingen公司）；Cy3和FITC荧光素标记二抗（武汉博士德公司）；dispase酶、高糖DMEM培养基、Percoll分离液（Gibco公司）；鸡胚提取液（自制）；BMP-2、碱性磷酸酶检测试剂盒（Centronic公司）；骨钙素检测试剂盒（MA, U.S.A.）。1 k5 C& b7 U+ ?9 J5 @2 ]& i9 t. h( V
5 K8 u2 ]; c/ c1 F 1.2原代细胞的获取与培养无菌条件下取志愿者肌肉组织约5g，在培养皿中用D-Hank's液洗涤组织、切成1mm3碎块，离心，去上清后，加入0.2%Ⅺ型胶原酶，37℃消化1h，离心后去上清液；加入0.3%dispase(grade Ⅱ,240 unit)，37℃孵育1h，离心后去上清液；加入0.1%胰酶，37℃消化30min，离心后细胞培养液（DMEM 20鸖 10%马血清 0.5%鸡胚提取液 1%青链霉素）重悬细胞，依次滤过100、200、400目的细胞滤网过滤，接种到多聚赖氨酸包被的培养瓶中，置于37℃，50ml/LCO2，95%相对湿度的培养箱中培养1h，未贴壁细胞移入新的培养瓶中，加入新的培养基培养1h后，未贴壁的细胞再次培养，如此反复，每次间隔24h更换瓶液，培养到5～6天时，贴壁的细胞为MDSCs，以后每天换液一次，倒置显微镜下观察，细胞生长融合到70%后，胰酶消化，以1∶2的比例传代培养。, a) i3 U% {0 N; q
! }4 g5 h L7 _8 L! h) k! O 1.3MDSCs鉴定应用免疫组织化学方法进行鉴定。纯化后的细胞接种于培养瓶中盖玻片加入DMEM培养基进行培养。待细胞长满盖玻片后常规处理，进行desmin、Sca-1抗体免疫细胞化学染色。荧光显微镜下观察记录。
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1.4诱导与成骨检测培养细胞用胰酶消化后，将细胞用培养液调整细胞密度至2107/L，加入24孔板中，每孔1ml。在5%CO2、37℃条件下培养24h，去培养液，加入含不同浓度BMP-2（30、60、90、120、150、180μg/L）DMEM，每组6孔，另设空白对照组。诱导分化后7d，分别收集细胞进行检测。放射性同位素标记免疫测定法测定培养基中的骨钙素含量［10］。细胞用PBS洗后，将其溶解（50mM Tris-HCl, 0.5% Nodient P-40, pH 7.5）。然后用4-硝基苯酚磷酸盐法检测细胞溶解物中的碱性磷酸酶在总蛋白中的含量［11］。1 F- E7 d m0 L7 a) K# h5 B; n
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2结果
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2.1MDSCs形态骨骼肌中分离出来的细胞主要由肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞及血液细胞等组成，差速贴壁法是根据各类细胞贴壁能力的不同，将其分离纯化，MDSCs贴壁较慢，一般在分离后5～6d贴壁，其体积较小，呈球形，折光性强，48h后完全贴壁，并开始增生，细胞逐渐变成椭圆形或纺锤形，进一步相互融合有规律地逐渐平行排列，最后形成成熟的多核肌管。
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2.2MDSCs鉴定免疫组织化学结果显示：具有细胞特异性desmin和Sca-1染色均为阳性，荧光显微镜下可见细胞发出的荧光。, u% n& p! b, E, [: Q6 m$ @/ o
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2.3不同剂量组间检测ALP、骨钙素含量结果见表1。
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骨骼肌中含有多种细胞成分，近年来发现了一群被称为MDSCs（muscle derived stem cells）的细胞群，是与肌卫星细胞完全不同的细胞群［1］，可能是一群未向任何方向定型的原始干细胞。肌卫星细胞是Mauro于1961年发现并命名的［2］，是肌源性细胞系的前体细胞，具有增殖分化能力的单潜能成肌干细胞，最终只发展为肌细胞。Lee等人从骨骼肌中发现了MDSCs［3］，是肌肉组织中没有肌源性限制的多能干细胞，是卫星细胞的祖细胞，它不属于肌源系谱，也不属于间充质组织。一般认为，在无诱导因素作用下，MDSCs定向分化为肌细胞和肌组织，研究表明其还能分化成成骨细胞，促进骨骼愈合［4］；在糖皮质激素作用下可分化为脂肪、软骨［5-6］；甚至可以分化为平滑肌或神经细胞［7-8］。2 z2 f# ~0 t+ Y/ s! J
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Preplate技术采用差速贴壁分离MDSCs，是利用成纤维细胞、内皮细胞的贴壁早于卫星细胞，卫星细胞的贴壁又早于MDSCs，实验证实4d时多种细胞已贴壁，MDSCs仍处于悬浮状态，培养液中即为较纯化的MDSCs。显微镜下观察MDSCs具有特征性的形态，进一步通过特异性的结蛋白desmin染色鉴定其肌源性，通过干细胞抗体Sca-1鉴定其干细胞特性。培养基中悬浮的MDSCs是小而圆的球体，折光性强，贴壁后逐渐变化为椭圆体、纺锤体，进而融合为排列规则的成熟多核肌管；适时分瓶扩增培养，其形态多代保持不变。从肌肉组织分离MDSCs时，使用胶原酶能够使纤维组织充分消解，组织块松软，变成乳糜状，在加入dispase酶使组织更加离散，最后胰酶将细胞从肌膜中消化分离出来，得到多种细胞的混合物，利用差速贴壁法纯化MDSCs。
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结蛋白desmin是目前公认的成肌分化的早期标志物，常作为肌源性的标志，在MDSCs中desmin阳性率可达90%，成纤维细胞、平滑肌细胞的desmin的阳性率仅为15%，由此可以进行初步的鉴别。另外干细胞抗原（stem cell antigen Sca-1）是目前为止一致公认的肌源性干细胞的标志［9］，本试验选用Sca-1单克隆抗体进行免疫荧光标记，MDSCs被染成红色，证实了其可行性和实用性。
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# j! u3 r" @3 B; O i BMP-2在诱导成骨方面具有重要作用，已被证实其可诱导未分化的间充质细胞向骨系细胞转化，在骨的发育和再生修复方面发挥着关键作用。本实验证实在BMP-2作用下，MDSCs形态发生显著变化，出现了胞体肥大并呈圆形的细胞，这些肥大的圆形细胞，经检测证实，其胞体内有ALP、骨钙素的表达。ALP、骨钙素是骨组织内的基质蛋白，特异性地由成骨细胞合成。经BMP-2诱导的MDSCs胞体内发现有ALP、骨钙素的表达，说明这些MDSCs已不再向肌肉组织转化，而向成骨细胞转化。不同BMP-2剂量组间，ALP、骨钙素含量差异显著，随着BMP-2剂量的增加，ALP、骨钙素含量相应增加，在BMP-2为150μg/L时，成骨作用最大，为最佳诱导剂量。) ?/ j8 w0 F6 X: ^
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MDSCs是存在于肌肉组织中的具有多向分化潜能的干细胞，近年来继骨髓基质细胞之后，在基因治疗和组织工程中日益受到重视。肌源细胞从自体较容易大量获得，如肌肉活检，对机体的损伤也小，安全可靠，分离提取的方法简便，免疫原性低，而且具有良好的体外繁殖能力，易于大量培养。本实验在动物实验的基础上，尝试探讨人MDSCs提取、分离、鉴定、诱导成骨的方法，为最终应用于临床搭建平台，该方法尚需进一步完善和优化。7 ]# R/ I8 y/ }' `! q1 Q/ e; W0 d
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表1不同剂量组间ATP、骨钙素含量（略）! p4 b0 g6 s8 r; D5 O( b# M, F: q
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发表于 2015-6-5 16:40
