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作者：魏会平 张世敏 刘继云 李继红 杨春玫作者单位：河北北方学院生物教研室 075000 5 I) W' g: g V; d1 u7 e5 S
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) ?0 i$ u- h0 y2 i [) Y# W 【摘要】 目的：探讨成体大鼠的间充质干细胞（MSCs）的分离、体外培养，为其应用提供理论依据。 方法：用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，传代扩增，对分离的细胞进行碱性磷酸酶的检测。 结果：取得较高纯度的成体大鼠骨髓MSCs，并保持细胞的活性；成体大鼠骨髓MSCs在体外培养中为贴壁生长的单个核球形细胞，培养3～4d后开始大量增殖，并形成形态均一的细胞增殖集群，对分离后所获得的细胞进行AKP染色为强阳性。 结论：采用密度梯度离心结合贴壁培养法可获得较高纯度的MSCs，是实用、便捷和可行的方法。并且在体外培养条件下能大量增殖，形成形态均一的细胞集落，可以成为进一步进行细胞扩增或其他实际应用的基础。
, s C8 |+ L5 `( F D$ w) y5 \1 B 【关键词】间充质干细胞；细胞培养；骨髓；大鼠
. ?- \/ }0 n n! H# d3 k3 L: G Isolating, Culturing and Biological Identification of Rat Marrow Mesenchymal Stem Cells
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WEI Hui-ping，ZHANG Shi-min，LIU Ji-yun et al.
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Hebei North University, Zhangjiakou, 075000, China# ~9 W2 \8 }5 x2 n) r& C, M
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【ABSTRACT】Objective: To explore a practical method of separation and culture in vitroof mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow of the adult rats, and to offer reference to its actual application. Methods: MSCs from rat bone marrow were separated and purifiedby means of gradient centrifugation and adherence to the culture plastic, then the cells were expanded by subculturing successively and Alkaline Phosphatase (AKP) of the separated cells was tested. Results:MSCs, separatedfrom the bone marrow of the adult rats, were collected in higher purity by means of gradient centrifugation and still kept the cells' activity. These cells, cultured in vitro, grew in an adherent mode on the wall and had a ball-like appearance. They were able to greatly proliferateafter 3～4 days of cultureand from the cell clones having the analogic cell shape . Alkaline phospha tase(AKP) stain of the separated cells showed strong positive results.Conclusion：It is a simple and practical method to separate MSCs from the bone marrow of adult rats by means of gradient centrifugationand adherence to the culture plastic. MSCs can greatly proliferate after ashort period of culture in vitro. Higher purity of MSCs，separated and cultured in vitro, will be very useful for its further research and applicatin.( `% R7 z+ u* Y" J3 j* i$ f
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【KEYWORDS】mesenchymal stem cells; cell culture; bone marrow; rat
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~# r& f9 k; z4 F, P4 g骨髓组织除含有造血干细胞外，还含有间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）。间充质干细胞（MSCs）是一类具有分化潜能的细胞，在特定条件下可以分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞以及神经星状细胞等，且具有极强的自我复制能力，是一种重要组织工程种子细胞［1］。由于MSCs具有独特的细胞增殖分裂模式，使外源基因易于导入和表达，而使其成为潜在的基因治疗靶细胞［2］。将其作为种子细胞用于细胞治疗和基因治疗的研究已成为当前研究的热点。而如何得到大量纯化的骨髓MSCs则成为临床利用这些细胞治疗疾病的前提。本实验拟通过体外培养的方法自骨髓中获取MSCs，并对其生物学特性、表型特征进行研究。为进一步探讨MSCs的诱导分化以及在组织工程中的应用提供理论基础。! z# a: k0 L$ d/ {# t2 H6 k5 \
! N* N$ G: e+ i 1材料和方法* D5 I6 s3 \- }1 o9 @- F& I
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1.1材料实验动物：一月龄sprague-dawley(SD)大鼠5只，雄性，体重80～100g，由河北北方学院动物室提供。试剂：DMEM培养基（GEBCO公司），胎牛血清（北京试剂商店），青霉素和链霉素（华北制药有限公司），淋巴细胞分离液（北京试剂商店）。
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! \" a1 D7 v# p4 W C1.2方法取一月龄大鼠，用木棒敲击头部处死，取股骨和胫骨，注意保留骨端部分不受损伤。用75%的乙醇浸泡消毒10min后移入超净工作台中，在无菌条件下，剪去骨头两端，露出骨髓腔，用含15%胎牛血清的DMEM培养基冲出骨髓，反复两次，用比重1.077的淋巴细胞分离液作梯度离心（2000转/min，离心30min）。收集单个核细胞界面层，DMEM洗涤2～3次，然后加入含15%胎牛血清的DMEM培养基，打匀后接种于6孔培养板中的3孔，在37℃，5%二氧化碳，饱和湿度条件下常规培养，于接种后24h换液，并将换取的培养液移入另外3孔，于接种后48h换液。从而形成0～24h贴壁细胞和24～48h贴壁细胞各3孔，以后每天换液，连续3d，3d后改为每隔两天换液，每天观察细胞形态并作记录［3］。
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8 ~* t9 y% B* p/ t% H. u- k1.3细胞体积测量和碱性磷酸酶（AKP）染色对分离后所获得的细胞取出少量细胞标本，将细胞离散，用图像分析仪随机测量20～30个细胞的直径，并进行AKP染色，染色后在倒置显微镜下观察染色结果，并选择离散的单个细胞显示染色结果。
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9 f/ H+ x1 h: d. B密度梯度离心所得到的细胞为比较一致的球形单个核细胞苔盼蓝，染色，细胞活力达98%左右，其他细胞少见。4 K! q8 [; Y) Y% Z0 ?: t! k( m! U6 U4 ]
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在显微镜下，对分离后所获得的细胞，用图像分析仪随机测量20～30个细胞的直径，其平均值大小为40μm左右。由于MSCs目前尚未有特异性的表面标志可用来检测，因此AKP的检测常用来作为鉴定干细胞的标志之一［4］，我们对分离所获得的大球形细胞进行AKP染色，结果呈强阳性。
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- ~. v% g/ u# r8 [! F接种骨髓的培养板，24h镜下观察发现，塑料培养孔底部有少量贴壁细胞，呈梭形，纺锤形和多角形，悬浮细胞大量存在；连续培养3d换液后观察发现悬浮细胞减少，大部分细胞贴壁，继而分裂增殖，呈集落式生长；培养7d后培养液中悬浮细胞已完全除去，只留下贴壁细胞。对比每个培养孔不同区域细胞分布发现，培养孔边缘部分细胞密集，形态有梭形，纺锤形和多角形。相对中央部分，位于外边缘的细胞长势好而且细胞体积大，即出现细胞边聚现象；培养14d后观察发现，细胞基本上长满整个培养孔。5 j$ E/ ~: p0 }- F7 z! t
8 p! R9 ?5 f5 K1 L/ k 3讨论
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6 s; ^9 {8 t% J$ D+ P& m骨髓中存在一定数量的MSCs，但同时也含有多种细胞成分（基质细胞、血管细胞、成纤维细胞，造血细胞等），所以，尽可能获得较高纯度的MSCs对于它的应用和推广有着重要意义。目前，对骨髓MSCs的分离、纯化、培养还没有统一的方法。早期用贴壁分离法，根据MSCs贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行分离，但所得到的细胞成分复杂，MSCs纯度不足；单克隆抗体磁珠分离系统或流式细胞仪技术对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性，而且实验条件要求较高，需要骨髓量大［5］。我们把密度梯度离心与贴壁培养法相结合，用淋巴细胞分离液对骨髓作梯度离心，除去大部分血细胞，获得纯度较高的单个核细胞苔盼蓝，染色，细胞活力达98%，说明该方法对细胞活力影响小，是一种比较理想的分离纯化方法。- q% n0 x" W5 E) t8 D9 o+ n
5 t! y& N9 {0 A3 G. p8 Z0 kMSCs是存在于骨髓中非造血干细胞的另一种干细胞，具有多项分化潜能，不仅能分化为造血实质，支持造血，还可分化为多种造血细胞以外的组织细胞。特别是中胚层和神经外培层来源的组织细胞。在实验条件控制下MSCs能分化成肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等。MSCs可聚集成均匀的集落，细胞表面蛋白如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD19、CD90、CD106、CD120a、CD124等呈阳性，但CD14、CD34、CD45造血谱系标记则呈阴性［3］。
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在MSCs培养过程中出现的细胞边聚现象可能是因为细胞在培养换液过程中边缘部分容易于塑料培养板粘附，贴壁容易所致。分离的骨髓MSCs还需进一步作生物化学分析，免疫组化和体内分化等的进一步验证。
, `# W/ }8 p- I% i+ g( G+ l 【参考文献】, V \ o6 ?5 r* p
1 Pittenger MF, Machy AM, Back SC, et al. Multilineage potential of adult human Mesenchymal stem cells［J］. Science, 1999,284(5411):1434 u4 w+ S/ H. M3 c
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2 何少键,陈维平.成体大鼠的骨髓间充质干细胞分离和体外培养的初步研究［J］.广西医科大学学报,2002,19(3):304-306: X D( O- R, Z' v
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( n: ~: m3 w( D7 \2 d; U 3 康新勤,藏伟进,宋土生,等. 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其形态观察［J］. 西安交通大学学报(医学版), 2003,24(5):518-519
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4 叶鑫生,许田,汤锡芳,等主编. 干细胞和发育生物学［M］.第二版.北京:军事医学科学出版社，2000. 4105
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8 X/ j s# {9 [8 ]5 E* n 5 张本斯,王凡,邓力,等.大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及表型和功能特点［J］. 四川大学学报(医学版). 2003,34(4):738-741 |
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发表于 2009-3-3 12:23
发表于 2009-3-6 18:06
