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向各位师兄师姐请教:我养狗间充质干细胞已经一个月了,可是一次也没成功过啊!希望能的到大家的指点!下面是我的培养过程:; t/ `; i4 A4 w9 g& M/ G* @6 C
每次常规消毒取骨髓10ML左右,用肝素抗凝,然后用密度为1.073的percoll与骨髓1:1混合4000转,30分钟,4度离心,每次能得到单核细胞层,然后PBS离心洗涤2次,接种于25cm2塑料培养瓶中,接种时在镜下观察可见大量细胞。然后放入培养箱养3天,然后换液,首次换液,我并没有用 PBS洗涤,直接将培养液加入培养瓶中,然后培养2天,第2次换液开始就用PBS洗涤2次,再加入培养基,如此重复。我的培养液用的是hyclone 的液体培养基,胎牛血清是四季清的,用的是20%的浓度,用前加入谷氨酰胺和双抗。0 W! C- X& W( I- _- |
在培养期间我也尝试园子里的前辈用的直接贴壁法,骨髓取来后直接加培养基接种于培养瓶中,1小时后首次换液,首次换液时也没用PBS洗涤,镜下观察可见大量贴壁细胞,但是第二次换液后,也很少见贴壁细胞,现在搞得我很郁闷啊。
" V4 Q. b+ W% \* N4 L* k ^8 L我的问题就是:原代培养时可以见着大量的圆型细胞,但是换完液后,基本上很少看见细胞,偶尔有一些细胞,其形态都是圆型为主,与典型的间充质细胞梭形结构完全不同,不知道这些圆形细胞是不是间充质干细胞,怎么换完液之后就很少有细胞长起来了啊,不知道是什么原因?还有就是接种密度过大也影响细胞的生长?再有就是10ml骨髓一般能接种几瓶培养瓶,我一般是接种5瓶左右?(25cm2)$ k0 _. l' z3 |5 y8 r8 l S
希望大家能帮忙给点意见,谢谢了!! |
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