乳腺成体干细胞体内及体外特性的实验研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:22 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：刘宝华张喆所剑  石爱平付士波　刘梅作者单位：吉林大学第一医院普通外科，吉林长春130021 8 f0 }% e2 w* I/ n* h/ P0 M



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      【摘要】  目的观察来源于乳腺癌患者的乳腺成体干细胞的体外生长特性。并将其移植到裸鼠体内，研究其体内的发展及变化趋势。方法以免疫磁珠分离乳腺成体干细胞进行体外培养。30只裸鼠，随机分为2组，以胸壁皮下细胞注射法移植入裸鼠体内，并以移植入MCF7乳腺癌细胞的裸鼠作对照。于术后行大体观察，术后6 w行组织学检查。结果乳腺成体干细胞在体外培养可以分化成导管上皮细胞及肌上皮细胞，将其移植裸鼠体内后形成的组织与肿瘤组织有明显差别。在组织切片中可见形成类似乳腺腺管样结构，未形成癌巢组织，并由结缔组织分隔成若干小叶，可见到大量的脂肪组织。结论经免疫磁珠分离的乳腺成体干细胞具有继续增殖及分化的特性，可以诱导裸鼠体内形成类似乳腺样组织，为乳腺形成及发育的研究提供一种新的方法。
      【关键词】乳腺癌；干细胞；裸鼠7 M5 {8 A8 \9 f" a
   　　Experimental study of characters of adult mammary stem cells in vitro and in vivo

　　LIU BaoHua, ZHANG Zhe, SUO Jian, et al
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　　Department of General Surgery, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

　　【Abstract】ObjectiveTo observe the growth character of the mammary adult stem cells (MASCs) in vitro and to explore the development in vivo by mammary stem cells transplantation into nude mice.MethodsMASCs were seperated by magnetic activated cell sorting (MACS) to culture in vitro. Thirty nude mice were divided into two groups randomly. MASCs and MCF7 cells were injected subcutaneously respectively in the axilla of mice as MASCs group and control group. The body observation was done after operation and histological examination was conducted 6 weeks after operation.Results MASCs cultured in vitro differentiated into luminal epithelial cells and myoepithelial. There was significant difference in tissues between MASCs group and MCF7 group. The similar lacteal glandular tube structure seen in the histologcial section did not form cancer nest tissue, was separated into several folials by connective tissue; and a great quantity of adipose tissue were be seen.ConclusionsMASCs separated by MACS can induce nude mice to form mammary tissue analog, having characters of proliferation and differentiation, which provide a new method for the research of the formation and development of mammary gland./ g; B9 M/ ~' d3 r% B

　　【Key words】Mammary gland; Stem cell; Nude mice# `3 Q/ g) T/ H* Y0 t. \

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乳腺干细胞（mammary stem cell，MaSC）是成体干细胞的一种，具有自我更新和分化为其他细胞系的能力〔1〕。乳腺干细胞的研究为乳腺再造及乳腺癌发生机制的研究提供了很好的模型系统。目前国外已利用免疫磁珠技术，成功地从缩乳术的乳腺组织中分离培养出乳腺成体干细胞〔2〕，但对其体内及体外的生长及增殖特性研究较少。本文从乳腺癌癌旁正常组织中分离、培养出一种具有干细胞特点的成人乳腺上皮细胞，并将其移植到裸鼠体内，在光镜下观察其形成组织的特点，为乳腺干细胞在临床的应用提供实验依据。

　　1 材料与方法1 @/ P2 n( |( M. I3 @- h# r
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　　11 标本、细胞及实验动物/ J% d. S4 ]& j3 n$ ]

　　标本取材于吉林大学第一医院乳腺外科2005年7月～2006年6月40岁以下乳腺癌患者手术中所切除的，距癌标本约3 cm，经病理证实无癌细胞浸润的正常乳腺组织。MCF7细胞由吉林大学放射生物实验室付士波博士赠送。实验动物：裸鼠30只，雌性，4～6周龄，未交配，体重19～22 g。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司（动物合格证号：SCXK(沪)20030003）；均饲养于SPF环境中。

　　12主要试剂及设备

　　DMEM/F12培养基（Gibco公司），10%胎牛血清（Hyclone公司），025%胰蛋白酶（Sigma公司），500 ng/ml氢化可的松，5 μg/ml胰岛素，50 mg/L青霉素，100 mg/L链霉素，10 ng/ml表皮生长因子，20 ng/ml霍乱毒素。CO2培养箱，超净工作台（苏州净化设备厂），倒置显微镜。6 i* P$ c0 O% f3 P

　　13 实验方法) l* L0 D' o6 W7 J* I

　　131 乳腺成体干细胞的分离培养及鉴定
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　　将乳腺组织去除脂肪组织，在无菌条件下漂洗、消毒，剪碎成1 mm3的组织块，用2 g/L的I型胶原酶5～10 ml消化2 h后离心。离心后的乳腺细胞用10%小牛血清的DMEM/F12培养基培养，025%胰酶消化、传代。' q5 }2 Y) ~+ I6 n; ~* F+ t) @  a
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　　132经免疫磁珠分离筛选乳腺成体干细胞
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　　将培养的乳腺细胞，经025%胰蛋白酶消化后用无菌PBS洗1次，调细胞浓度为1108/ml。加入MUC抗体10 μl，4℃，放置30 min。取细胞悬液80 μl加入标记有羊抗鼠抗体的免疫磁珠20 μl，4℃孵育15 min。加2 ml PBS离心，用500 μl PBS重悬细胞。将磁分离柱置于分离仪上，从分离柱的上端加入500 μlPBS，PBS流出后弃去。将500 μl免疫磁珠标记好的乳腺细胞悬液加入分离柱，MUC阴性细胞流出分离柱。收集细胞加入ESA抗体10 μl，4℃，放置30 min，重复上述过程，ESA阳性细胞因标记有免疫磁珠，在磁场作用下阳性细胞留在分离柱中。收集磁柱上的MUCESA 细胞加入培养基培养。# C9 N& E' A  \0 t, Y

　　133分离后培养的乳腺成体干细胞的鉴定* y! t4 R& o& o2 f
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　　将传代的人乳腺干细胞悬液以1105/ml接种于预先置入盖玻片的6孔培养板，直径35 cm，各孔加入2 ml DMEM/F12培养液。免疫组化法检测人乳腺干细胞CK19抗原表达：对照孔和实验孔分别于培养第7、14天，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗；3%H2O2消化内源性过氧化物酶10 min，PBS冲洗；加入鼠抗人CK19单克隆抗体；湿盒4℃过夜；37℃复温1 h，PBS冲洗后滴加生物素连接二抗，37℃孵育30 min；PBS冲洗后DAB显色，系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，以不加一抗样本作为空白对照。' Z; C9 w5 y/ L3 B& N

　　134 裸鼠皮下接种* j' j6 M" F1 Y/ P' ^

　　将分离后培养的乳腺成体干细胞经025%胰酶消化、PBS洗涤2次后，用PBS将细胞浓度调至1107/ml。将裸鼠置于层流超净台中。在裸鼠胸壁第5～6肋间皮下接种细胞悬液01 ml，即106/只，共随机接种15只裸鼠，并以15只裸鼠接种MCF7乳腺癌细胞106/只作为对照。继续饲养在SPF环境中。注射后做大体观察。术后6 w处死取材，经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，做10 μm切片，用于HE染色，做组织学检查及光镜观察。
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　　2 结果' g$ K) d( w9 R5 |6 q
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　　21 分离后培养的乳腺成体干细胞形态学观察3 @, t6 H* @4 ~+ \1 P. R
! [0 X: Z0 }9 f
　　培养5 d，细胞团周围有游离出的个别导管上皮细胞，呈圆形，折光性强。7 d时细胞已在细胞团周围出现晕圈，并向周围扩展铺开。2 w时细胞密度增加，增殖旺盛，并进一步汇合。可以传代。在传代过程中可见到逐渐分化的长梭形的肌上皮细胞。见图1。+ {# e! ?- [+ Z. u( {, W

　　22乳腺成体干细胞鉴定结果

　　经免疫磁珠分离的乳腺成体干细胞行MUC、ESA及CK19免疫组化染色，可见大部分细胞染色阳性。CK19染色阳性细胞表达其阳性反应颗粒均位于胞浆内及核膜周围，少数位于核内。
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　　23 移植裸鼠的形态学观察
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　　注射乳腺成体干细胞组2 w时，触摸注射部位形成结节，突出于皮下。3～4 w，大体观察隆起物逐渐变大。6 w时处死动物获取标本，见标本呈乳白色，质韧，较小，约05～1 cm，包绕一层疏松结缔组织，类似于乳腺腺体样组织。注射MCF7乳腺癌细胞组1 w时即可肉眼观察到肿瘤小块，植入4 w时肿块表面出现溃疡。6 w时处死动物时可见肿瘤体积较大，约1～2 cm，瘤体血管丰富，与皮肤有黏连，有的肿瘤有破溃，部分小鼠出现肺及胸膜转移。
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　　24移植物HE染色切片的光镜观察
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　　注射乳腺成体干细胞组，导管上皮细胞呈长柱状紧密排列，胞核强嗜碱性，长椭圆形，胞质较少，弱嗜酸性；在组织切片中可见已形成导管样结构，外周包有长梭形细胞的细胞团索，有的能见到中央的空腔。导管外结缔组织区域有较多而大的小动脉、静脉。见图2。在距管腔较远的区域，可见结缔组织分隔呈若干小叶，小叶之间界限清晰。每一个小叶中有大量的上皮细胞索，还可见到大量的脂肪组织。脂肪细胞呈空泡状，核位于一侧，呈月芽，椭圆形不等。还可见到一种长梭形的细胞，胞体较小，核椭圆形，可能为肌上皮细胞。见图3。注射MCF7乳腺癌细胞组，组织切片可见癌细胞呈多角形或椭圆形，生长旺盛，核分裂相多见，呈巢状排列。癌巢中央常见坏死出血，癌间质组织呈条索状。

　　3 讨论% I$ y: S& }- O2 Z7 W& a! I& b% J
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2002年3月，丹麦 Peterson〔2〕领导的小组首先宣布，从缩乳术的乳腺组织中，利用免疫磁珠方法分离培养了成人乳腺干细胞，乳腺成体干细胞一般处于静止期，寿命较长，能产生新的干细胞，以维持干细胞群体的存在。在孕期、哺乳期及复旧期通过乳腺干细胞的分裂及分化可以形成大量的组织扩张及塑型，同时可以对组织损伤进行修复。% a! L7 K; s1 m9 C% j( R  w6 A; l; `

目前分离乳腺成体干细胞主要有免疫荧光细胞分离（fluorescence activated cell sorting,FACS)和免疫磁珠细胞分离（magnetic cell sorting，MACS），都需要应用细胞表面干细胞抗原标志物分离，主要有ESA（epithelial specific antigen）及CK19 (cytokeratins19)。乳腺成体干细胞的鉴定还可用烟酸己可碱33342染色（Hoechst 33342），因干细胞中具有多药物阻抗转运蛋白(multidrugresistant protein,Mdr1)，可以活跃的将药物泵出细胞，故染色呈阴性。但由于染料对细胞有毒性作用，故限制了有功能细胞的分选。

本实验应用免疫磁珠细胞分离系统成功分离出乳腺成体干细胞，其原理是已包被一抗的磁株与细胞表面相应分子特异性结合，磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱上，实现阳性细胞分离及阴性细胞的分离。用免疫磁珠分离出的乳腺成体干细胞CK19免疫组化染色阳性〔3〕。CK19是一种最早在胚胎内表达的角蛋白，也大量表达在乳腺干细胞内。当乳腺干细胞逐渐分化成导管上皮细胞及肌上皮细胞后，可以由CK19阳性细胞逐渐转成阴性细胞。分化出的导管上皮细胞CK18染色阳性，肌上皮细胞CK14染色阳性。
8 X# t4 C/ ?. r* ]8 q( z
Stingl等〔4〕通过体内体外实验证明乳腺成体干细胞是一种独立的具有自我更新能力的细胞，在孕期及哺乳期乳腺干细胞被激活，从而分化成不同阶段的祖细胞，再逐渐分化成为成熟的乳腺细胞。2006年Shackleton等〔5〕利用小鼠乳腺细胞表面干细胞抗原CD29及CD24成功分离出富含小鼠乳腺干细胞的细胞亚群，证实其具有自我更新和分化的能力，将其移植到不含LacZ基因小鼠体内，可以再次生长出含有LacZ基因的乳腺干细胞，并分化为导管上皮细胞和肌上皮细胞，形成有功能的管泡单位，在孕期可以分泌乳蛋白。
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本实验选用裸鼠作为乳腺成体干细胞体内移植模型，因裸鼠为胸腺缺失，T细胞免疫缺陷小鼠，已广泛应用于肿瘤体内移植方面研究。并以MCF7乳腺癌细胞株作为对照组。在裸鼠体内实验中发现乳腺干细胞移植后形成的组织与肿瘤组织有明显差别。①乳腺成体干细胞形成组织生长相对较慢，但较稳定增长。有包膜，无体内转移。而肿瘤组织则形成时间短，生长速度较快，可伴有体内转移。②从组织学切片上看，乳腺成体干细胞组形成类似乳腺导管样结构，在导管的基部和上皮细胞索中见到的梭形细胞可能就是肌上皮细胞。在周围分隔的结缔组织中可见到脂肪细胞，未见到典型的腺泡结构。考虑需要在雌激素和孕激素的作用下，乳腺结构才可能由导管结构形成真正的腺泡，还需要进一步观察。而肿瘤组织核分裂相多见，呈巢状排列。癌巢中央常见坏死出血。这些结果提示乳腺成体干细胞具有在体内继续增生和分化的活性，为进一步研究乳腺的发育及乳腺肿瘤的形成提供了新的实验材料。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(30300336)
      【参考文献】
　　1  Smalley M，Titley O′Hare MClonal characterization of mouse mammary luminal epithelial and myoepithelial cells separated by fluorescence activated cell sorting〔J〕In Vitro Cell Dev Biol Anim，1998;34(9):71121

2 X% v0 b3 t: A5 ?2 ?
- j/ \- N9 m% S# E
　　2 Gudjonsson T,Peterson OWIsolation immortalization and characterization of a human breast epithelial cell line with stem cell properties〔J〕Genes Dev,2002;16(6):6937068 B  k; A2 K/ L

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# C5 `: I$ z! h9 s# j2 w7 a) M( g
　　3  Clayton H，Titley IGrowth and differentiation of progenitor/stem cells derived from the human mammary gland〔J〕Exp Cell Res,2004;297(2):44460- T4 h+ l* R. k' |  t0 B% S
# X) X3 ]8 t4 e$ A3 k; Z( I

2 C1 b  U, \! J( T# y: _7 R
　　4 Stingl J，Eirew PPurification and unique properties of mammary epithelial stem cells〔J〕Nature，2006;439(7079):9937: H9 U( m1 ?5 u

& d1 v1 h8 c- A' X
　　5 Shackleton M，Vaillant FGeneration of a functional mammary gland from a single stem cell〔J〕Nature,2006；439(5):848

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