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作者：虞海流作者单位：.东南大学临床医学院,江苏 南京 210009; b9 c8 B7 {) k. z8 c3 O( h
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【摘要】 目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)离体分离和培养方法,探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF）、表皮生长因子(EGF）、全反式维甲酸(RA）、骨形态发生蛋白7（BMP7）在体外诱导BMSCs向神经干细胞（NSCs）分化的作用。方法采用出生4周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为3组:A组，bFGF＋EGF＋RA进行诱导分化;B组，BMP7进行诱导分化;C组，不加因子继续培养。在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单抗鉴定。结果A组诱导7d后有部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达。而B组、C组细胞仍为典型的成纤维细胞形态,无NSE阳性细胞。结论bFGF、EGF和RA可以联合诱导BMSCs向NSCs分化,并可调控神经元分化,而BMP7在此种诱导条件下未见明显的诱导BMSCs向NSCs分化的作用。 n. F5 d5 J5 I s. X
【关键词】骨髓间充质干细胞 神经干细胞 成纤维细胞生长因子 表皮生长因子 全反式维甲酸 形态发生蛋白7% @; J9 t: |; f6 p1 j5 p8 v
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Study on the culture and differentiation of bone4 k+ B" n& H9 m( l& N( O4 @4 k
+ w. m# _+ L- \: T: H; {marrow stromal cells from adult rats1 `" e, E" o3 x+ N" [: ~+ x' F7 u; t
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7 p3 ]7 `# E3 s3 I* _( G: M YU Hailiu，JIANG Zanli，MAO Zubin
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1.School of Clinical Medical Science,Southeast University，Nanjing 210009,China;$ h! u, q/ k# B0 `, ]
6 A+ x8 u* K' x0 O: j- M- ]- X 2.Department9 ?" x# U7 G; s
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of Orthopaedics,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China
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Abstract:ObjectiveTo investigate the isolating and culturing methods of rat bone marrow stromal cells（BMSCs）in vitro and to study whether adult BMSCs could be induced to differentiate into neural stem cells（NSCs）and neurons by basic fibroblast growth factor（bFGF）,epidermal growth factor(EGF）,alltransretinoic acid（RA）andbone morphogenetic protein7（BMP7）.MethodsAdult marrow stromal cells were cultured from bone marrow of four weekold SD rats.bFGF EGF RA(group A)and BMP7(group B)were used to induce the thirdgeneration BMSCs,and contrasted with the cells that had not been induced.Phase contrast microscope was used to observe the differentiation of BMSCs daily.Immunohistochemistry technique was used to identify the differentiated BMSCs with neuron specific enolase（NSE).ResultsAfter seven days of culture,some BMSCs in grupe A appeared typical morphological neuronal traits.Cell bodies appeared refractile,conelike or spherical with long processes,NSE was expressed in group A.The cells in group B and group C still had no NSE expression.ConclusionCombination of bFGF,EGF and RA can induce BMSCs to differentiate into NSCs and neurons,and can regulate the differentiation and promote the maturation of neurons.But BMP7 can not induce BMSCs to differentiate into NSCs and neurons at this condition.
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Key words:bone marrow stromal cells;neural stem cells;fibroblast growth factors;epidermal growth factor;alltransretinoicacid;bone morphogenetic protein7+ O* O9 F' P, [- o1 U2 p& j
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神经系统损伤后的修复是困扰神经科学的一大难题,神经干细胞(NSCs）的发现和移植治疗为解决此难题提供了一条新的途径,并成为近年来的研究热点。然而,传统的胚胎来源和脑来源的NSCs由于取材困难,并受伦理道德的约束,使其应用受到极大的限制。骨髓间充质干细胞(BMSCs）具有多分化潜能,可以在体外诱导生成骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞和神经元样细胞[1] 。因此,使用诱导BMSCs生成的NSCs治疗神经系统的变性、外伤或遗传性疾病将成为可能。而寻找和探索恰当的细胞因子和培养条件,将BMSCs诱导分化成合适的神经前体细胞,是神经细胞移植的前提条件。本研究以SD大鼠为实验对象,观察BMSCs 体外培养的生长行为，探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(RA)联合及骨形态发生蛋白7（BMP7）在体外对BMSCs向NSCs和神经样细胞分化的诱导作用。! ^4 |; m; t& ]/ x) l5 g
' r" j4 c! N P1材料与方法
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/ u; N9 Z o9 @+ b. s! c1.1实验动物及试剂# x# Y9 D$ H- m2 P/ l3 i
: c9 L% ]: z/ ?1 G: [! C' ?出生4周SD大鼠(雌雄不拘),体质量150g左右,由东南大学医学院实验动物中心提供。低糖DMEM培养基、胎牛血清(FCS)、BMP7、EGF、bFGF、RA、神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体均为SIGMA公司产品。SABC试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂为武汉博士德公司产品。0 R( g+ f# w4 S0 g
# ^% V/ x. Y5 F8 H1.2BMSCs的培养和纯化# D' x# c& I& r2 p$ m4 w- y
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取SD大鼠1只,100g·L-1 水合氯醛麻醉后体积分数75%乙醇浸泡3 min,于超净工作台上严格无菌条件下取大鼠双下肢,剪除软组织,留取股骨和胫骨。将骨骺端剪去,暴露两端骨髓腔,使用5ml注射器抽取DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,冲洗液收集于无菌离心管中,1000 r·min-1 离心5min 。弃去上清液,加入体积分数20%血清培养液,充分吹打至单细胞悬液,调细胞浓度为4108个·L-1,接种于培养瓶中。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。4d后全量换液,去除未贴壁细胞。以后每3d换液1次,待细胞长至80%～90%融合后,用含0.25 g·L-1 胰酶的消化液消化,以细胞密度4108个·L-1 接种传代。 @/ w; b0 y. [) ]4 {& S3 N8 H4 t
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1.3诱导和分化9 W4 }0 |- u# M/ p
d, w2 }4 O: ~传至第3代MSCs按1104个·ml-1浓度接种于6孔板中,培养液改用DMEM加20%胎牛血清,待细胞融合达90%后,分为A、B、C3组。预诱导24h后，A组加入EGF、bFGF和RA联合诱导剂（终质量浓度为300ng·L-1），B组加入BMP7诱导剂（质量浓度为20μg·L-1），C组不加因子继续培养。倒置显微镜逐日观察细胞形态变化。
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1.4细胞免疫组化染色及观察
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3组细胞诱导培养后第7天,调细胞浓度为4108个·L-1,分别将3组细胞接种入24孔培养板,每孔0.5ml,贴壁24h后40 g·L-1多聚甲醛固定,分别进行NSE免疫组化鉴定,DAB显色,倒置显微镜下拍照记录,细胞浆呈棕黄色者为阳性细胞。& K k: b1 b ^' s3 Q% N
9 W* i% U+ X! X. _/ x2结果
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2.1BMSCs 的培养扩增
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/ B( g7 \% Z2 a初接种的细胞种类较多,大部分呈圆形。接种24h后可见部分大圆形单核细胞贴壁,骨髓中的造血干细胞不会贴壁,可在每次换液中逐渐清除掉。原代培养36～48h后贴壁的单核细胞开始增多,但仍保持圆形。72h后细胞开始增殖迅速并出现多种形态。大多数细胞呈梭形并带有2～3个长的突起,细胞核较大,扁圆形,可见1～2个核仁。少部分细胞呈不规则形,形态多样,胞体大,胞核为圆形或椭圆形,有多个核仁,胞浆可向不同方向伸出突起,细胞集落间相互融合成单层,排列具有一定方向性。细胞倍增时间约为7～10d,刚经传代的BMSCs 呈圆形,迅速贴壁、伸展,重新变为梭形细胞（图1A）。传代培养的细胞比原代细胞增殖速度加快,但也存在1～2d 的潜伏期,第3～6d是细胞快速增殖期,9d后速度减漫,进人平台期。反复换液和传代培养去除非贴壁细胞,至第3代的BMSCs形态基本单一，呈梭形或扁平形,增殖至细胞融合时,倒置相差显微镜下观察呈漩涡状排列（图1B）。3 x3 f0 l U! Y' C
+ M: `8 z( Y7 ]' V2．2BMSCs 的诱导分化
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4 K8 T( p8 `2 h1 E; GA组细胞经诱导3d后可见转化的细胞增殖分裂成小圆形,呈团簇状半悬浮状态。对这些细胞进行连续观察,发现其胞体逐渐增大,并有突起逐渐伸出、延长,诱导7d 后可见大量具有2个或多个突起的细胞,胞体呈大多角形或不规则形,类似于神经元和胶质细胞形态,折光性较强,细胞突起间相互连接成网状,可见细胞核和核仁（图1C）。B组和C组细胞诱导后未出现类似变化，仍为典型的成纤维细胞形态。6 l6 Q% v" l* w u3 G
1 `& V" c2 V$ \/ Q- b! q9 n3讨论
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: Z' ?& O o9 M$ E$ E近年来的研究表明，BMSCs可向神经类细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、网状细胞、脂肪细胞等方向分化[23] 。但由于BMSCs 在骨髓中的存在率仅为0.1%,其在自然状态下大多向成纤维细胞方向分化,向神经细胞方向分化的比例非常低[4] 。因此,必须在体外进行培养扩增,并寻找高效的诱导方案。本实验采用密度梯度离心法，利用BMSCs易黏附塑料的特性,经过换液和传代,分离BMSCs。同时通过不同的诱导条件,对BMSCs 进行诱导分化。研究发现,添加不同的诱导剂,可诱导出不同比例的神经样细胞。bFGF的作用广泛而复杂,能维持由EGF激发的NSCs的存活及增殖,有诱导NSCs向神经元分化的作用,并可维持神经元和神经胶质细胞的存活,诱导神经元合成神经特异性基因(SCG2100)产物和乙酰胆碱转移酶,并能促进交感神经和副交感神经的轴突生长,具有丝裂原样作用[56]。EGF是有丝分裂的促进因子,其作用没有种属特异性,对NSCs分裂有促进作用,可诱导NSCs向星形胶质细胞分化,促进神经元轴突的延长和维持神经元的存活[7]。RA是维生素A的衍生物,能够明显增加神经细胞的数量并呈剂量依赖效应,能调节对EGF有反应的NSCs分化,增加神经元细胞和星形胶质细胞的合成[8]。BMPs是转化生长因子超家族的一员，在骨的发育和结构维持方面发挥极其重要的作用。最新的研究显示，BMPs在一定因素下具有诱导干细胞向神经细胞分化的作用[9]。8 v6 s* M. `. w) ]5 _/ [/ b1 }
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本实验结果表明,从成年大鼠骨髓中分离得到的BMSCs,可在体外扩增得到大量分化潜能稳定的子代细胞,为下一步BMSCs 移植治疗奠定了基础。应用全骨髓贴壁筛选培养法,BMSCs于接种后1h即开始贴壁,72h完全贴壁,3～4d后进入对数增长期,14d左右即长满培养瓶壁。消化传代细胞接种后无增殖潜伏期,可于1周内再次长满瓶壁。传代后的细胞形态无明显变化且性质稳定。该方法简单高效,易于掌握和推广。bFGF、EGF和RA联合诱导3d后部分BMSCs 可转变为神经元样细胞,出现轴突和树突样结构,且多个神经元间可形成网络连接。诱导7d后鉴定结果显示该细胞有神经元标记物NSE表达。而应用BMP7在此种诱条件下诱导BMSCs，形态上未见向NSCs分化的倾向，免疫组化结果显示未见神经元标记物NSE阳性细胞。对照组亦无阳性细胞出现。
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本研究结果显示，经过EGF、bFGF和RA的联合诱导,BMSCs在形态学上呈神经元样细胞形态,细胞突起增多,折光性增强,且分化的细胞表达神经元细胞的特异性标记NSE，说明EGF、bFGF和RA可联合诱导BMSCs分化为神经元样细胞。文献报道β巯基乙醇的诱导作用快且强,但分化后细胞存活时间过于短暂,2h 即有细胞漂浮,6h大部分细胞溶解、死亡,实际应用价值并不大[10]。本研究诱导的神经元样细胞出现较迟,72h才有形态学改变,7d大部分细胞仍能存活并可表达神经元细胞的特异性标记,经多次换液和传代细胞仍较稳定,说明本研究采用的诱导分化系统不仅成功诱导分化出神经元样细胞,且分化细胞寿命远大于目前文献报道,多次传代后细胞形态和性质稳定,为今后开展NSCs 移植研究奠定了实验基础。而在此种诱导条件下用BMP7诱导BMSCs未见有向神经细胞方向分化的倾向，考虑可能为诱导条件不适宜，尚需进一步摸索诱导条件，本课题组考虑能否用BMP7基因转染等方法诱导BMSCs向NSCs方向分化，此尚需进一步研究。
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目前,在体内或体外拟诱导NSCs特异地分化为特定表型的神经元尚有一定困难,随着对细胞因子在NSCs增殖分化过程中作用的进一步研究和与基因调控手段的结合,有望能精确地控制NSCs向功能神经细胞分化的比例,对NSCs移植治疗中枢神经系统疾病有重大意义。
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发表于 2009-3-3 12:17
发表于 2015-6-14 11:43
