体外诱导人脐血间充质干细胞未能向心肌细胞转分化 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 11:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：王蓓， Marisa Jaconi，Biagio Saitta, Vladimir Markov作者单位：1.卫生部北京医院急诊科，北京 100730　2.日内瓦大学病理免疫研究室，瑞士日内瓦大学医学院, 瑞士日内瓦　3. Coriell医学研究所，美国新泽西州   U1 K+ _: |6 A" s( M  [# M% B, j
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      【摘要】  目的  选择从人脐带血中分离出的间充质干细胞（UCB1MSCs），通过5氮胞苷(5aza)进行诱导，对其体外向心肌细胞转分化的能力做初步探讨。方法  培养第11代hMSCs，加入6、9、12 μmol/L的5aza分别作用24 h和48 h，相差显微镜观察细胞形态直到3周后实验结束。以未经处理的细胞为对照组。采用RTPCR检测心肌转录因子MEF2C、GATA4、Nkx2.5和心肌特异性基因MLC2v、MLC2a、Connexin 43及αactinin的表达；免疫荧光染色检测Connexin 43和αactinin的表达,以共聚焦显微镜成像。结果  经5aza诱导后观察3周未见细胞的自发搏动。诱导前后的hMSC均可不同程度的表达MEF2C、Connexin 43及αactinin。在12 μmol/L水平诱导24 h和6、9、12 μmol/L水平诱导48 h共4个组中可见MLC2 a的表达。GATA4 、Nkx 2.5和MLC2 v在诱导前后均未见表达。免疫荧光染色显示诱导前后hMSCs的胞浆内存在散在排列无序的αactinin和Connexin 43荧光，而始终未见肌小节结构。结论  经5aza诱导UCB 来源hMSCs在基因水平可以表达部分心肌特异性基因，但是在诱导后的一个月时间内未见相应的心肌特异性结构出现，此类细胞向心肌细胞转分化的能力需再证实。
      【关键词】间充质干细胞；脐带血；心肌分化；心肌细胞
   　　Human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood fail to transdifferentiate toward cardiomyocytes in vitro
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　　WANG Bei, Marisa Jaconi, Biagio Saitta, Vladimir Markov
, j) F7 s) z  H6 S* D$ ?- m
　　1. Department of Emergency, Beijing Hospital, Beijing 100730, China;

　　2. Coriell Institute for Medical Research, New Jersey, USA;

　　3. Department ofPathology and Immunology, Geneva Medical School, Switzerland: m/ E( X0 j7 H2 j! y# }

　　Abstract：ObjectiveThe aim of this work was to assess in vitro the transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cells (hMSCs) derived from umbilical cord blood (UCB) (called UCB1MSC) into cardiomyocytes by treatment with 5azacytidine (5aza).MethodsUCB1MSCs in culture (passage 11) were treated with different concentrations of 5aza (6, 9, 12 μmol/L) for 24 and 48 hours respectively, and their phenotypes were assessed after 3 weeks of culture. The expressions of cardiacspecific transcription factors (MEF2C, GATA4 and Nkx2.5) and structure genes ［ventricular and atrial myosin light chains (MLC2v and MLC2 a), connexin 43 (Cx 43) and αactinin］ were analyzed at the mRNA level by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) , at the protein level by westernblot or by indirect immunofluorescence (Cx and αactinin) using confocal microscopy.ResultsOver 3 weeks observation, both untreated and treated UCB1MSCs did not display cardiaclike or myogeniclike phenotype. RTPCR analysis revealed the expressions of MEF2C, αactinin and connexin 43 in both untreated and treated hMSCs. In contrast, 5aza treatment was able to induce the mRNA expression of MLC2a, at a concentration of 12 μmol/L applied for 24 hours and at all concentrations when applied for 48 hours. By immunolocalization, the distribution of αactinin and Cx 43 in both treated and untreated hMSCs was disorganized and sarcomeres were never observed.ConclusionsHuman MSC from UCB (UCB1hMSC) could be induced to express some cardiacspecific genes at the mRNA level by 5aza, but coherent cardiac myofibrillogenesis does not take place over a period of almost 1 month. Therefore, the effective transdifferentiationpotential of these cells toward cardiomyocytes remains to be demonstrated.& M( _6 m5 }2 F' N

　　Key words：Mesenchymal stem cells;Cord blood;Cardiac differentiation;Cardiomyocytes

　　近年来干细胞移植作为一种新的促进缺血性心脏病心肌修复的方法受到广泛关注。来源于成人骨髓（bone marrow, BM）的间充质干细胞（human mensenchymal stem cells, hMSCs）因取材相对便易，且避免了伦理学的争议，成为心肌细胞移植实验和临床研究的主要种子细胞[1，2]。而从其他组织如脐带血（umbilical cord blood, UCB）等获得的MSCs在这方面的研究则相对不足。为此本实验选择从人UCB中分离出的MSCs亚群（称之为UCB1MSC），通过5氮胞苷(5azacytidine，5aza)进行诱导，对其体外向心肌细胞转分化的能力做初步探讨。$ j4 {( s8 H( ]  l! l. J
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1材料和方法- h2 v) N" Q& V/ a& N5 x
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　　1.1人脐血间充质干细胞（hMSC）的培养
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人脐血间充质干细胞株（1022021）和转染绿色荧光蛋白的人脐血间充质干细胞株（MSCGFP）均由美国Coriell医学研究所 Biagio Saitta教授惠赠，分离自人脐带血，第1013代。解冻－180℃液氮保存的第11代hMSC制成细胞悬液，以1106/ml密度接种于0.1%明胶处理过的6孔板中，加入5 ml培养基，成分包括高糖DMEM（Gibco公司），10%胎牛血清（FBS, Gibco公司），1 mmol/L青/链霉素, 2 mmol/L谷胺酰胺。放置于37℃的5% CO2培养箱中培养，每隔2～3 d换液1次。& Y1 z; D! B! I& X
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　　1.25aza诱导

将贴壁的hMSC以0.25%胰蛋白酶室温下消化5 min, 1000 r/min离心5 min,制成DMEM悬液，以5104/孔和12104/瓶的密度分别接种于6孔板和25 ml培养瓶中。待细胞贴壁后，以DMEM清洗，然后加入含有水平为6、9、12 μmol/L 5aza（Sigma公司）的培养基，放置于CO2培养箱中分别作用24 h和48 h。其后以新鲜培养基洗涤并继续培养，每天观察，每2～3 d换液一次，直到３周后实验结束。4 p: O) M9 y) F% Z7 n' f& K

　　1.3RNA提取和RTPCR- C6 q2 t2 p3 T! r. T/ F

　　1.3.1总RNA的提取
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　　3周后实验结束，将5aza 处理后的细胞经PBS洗涤后按RNA提取试剂盒说明书（RNeasy Mini kit购自Qiagen公司）提取总RNA。终样品测定A260/280以确定RNA质量。2 F4 o$ u5 u( D& |" c4 x/ S1 V
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　　1.3.2逆转录

　　每20 μl逆转录体系中含1 μg总RNA、0.25 μg Oligo(dT)、4 μl 5XPCR缓冲液、1 μl dNTP(10 mmol/L)、1 μl DTT（0.1 mmol/L）和200U superscript II Rnase H Reverse Transcription（购自Invitrogen公司）。反应条件为：42℃ 90 min, 72℃ 7 min, cDNA于4℃保存。

　　1.3.3引物设计及PCR反应
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　　目的基因和内参照基因（人GAPDH）的特异性引物和PCR扩增产物长度及反应条件见表1。反应体系为50 μl，对GATA4、MEF2C、MLC2V和GAPDH的扩增包括：２ μl cDNA模板、３ μl MgSO4、1.5 μl dNTP(10mmol/L)、２ μl引物和0.41 μl Taq 聚合酶（购自Qiagen公司）；对Nkx2.5的扩增，以5 μl Q 溶剂（购自Qiagen公司）代替３ μl MgSO4 。PCR循环参数为：94℃变性5 min,接着开始循环(94℃ 1 min，Tm 30 s, 70℃ 1 min）, 最后70℃延伸7 min。人心肌组织cDNA为阳性对照。水为阴性对照。以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，经溴乙锭染色，在紫外灯下观察目的条带，并记录。表1PCR 引物序列、产物长度和反应条件（略）

　　1.3.4免疫荧光染色
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　　肌节肌动蛋白(sarcomeric αactinin)：一抗为鼠抗抗体（Sigma公司，1:100稀释），二抗为兔抗鼠IgG（FITC连接，Sigma公司，1:200稀释）；缝隙连接蛋白43(connexin43)：一抗为鼠抗IgM单型抗体（Sigma公司，1:200稀释），二抗为马抗鼠IgM（FITC连接，Sigma公司，1:300稀释）。免疫荧光染色如下：实验结束后，用PBS清洗贴壁生长于盖玻片的细胞，室温下以1%的多聚甲醛固定15 min,0.1%的TritonX100 细胞膜打孔30 min,1%的牛血清白蛋白（BSA）封闭，滴加一抗4℃过夜，再加入二抗放置在37℃培养箱1 h,其后ToTo3碘化物（Molecular Probes公司，1：1000稀释）进行核染色30 min，PBS充分清洗后，Mowiol封固。阴性对照采用PBS代替一抗，余操作同上。阳性对照采用新生鼠心肌细胞的αactinin和connexin43同法染色。
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　　1.3.5免疫荧光染色成像) A% ~' C# e9 ~  J( e3 S

　　将染色的hMSC 和hMSCGFP放置在Nikon反转显微镜下（TE2000，物镜60X），利用Nipkowtype高速共聚焦系统 (Ultraview RS, PerkinElmer,英国)观测荧光变化。用高速CCD照相机成像后电脑记录。
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　　2结果- }( P! j$ N. k/ c" E' w
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　　2.1P11 hMSC细胞形态. ?% }/ Y) I2 Q& @# S9 }
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未经5aza诱导的P11 hMSC如接种密度较高则生长迅速，当融合达90%以上时呈形态均一的长梭形成纤维母细胞样，排列密集。但当hMSC接种密度较低时（5000/cm2），可观察到细胞增殖缓慢，胞体短而宽大，形态不规则，有不同方向的伪足，并观察到少许细胞有双核（图1A）。

经5aza诱导24 h和48 h之间细胞形态无明显差别，观察3周始终未见细胞的自发搏动。3种水平诱导后hMSC的增殖速度均较未诱导的细胞减慢，且与加入的5aza水平相关，以12 μmol/L 组的hMSC细胞数量最少,可见部分细胞内有脂肪空泡形成（图1B）。
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　　2.2RTPCR结果+ h' }2 s. A( V5 R8 F  e) y5 @
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5aza诱导前后的hMSC均可不同程度的表达心肌特异转录因子MEF2C和心肌结构蛋白Connexin43及αactinin。在12 μmol/L诱导24 h和3种水平诱导48 h共4个组中可见MLC2a的表达，其他组未见表达。其他心肌转录因子GATA4 、Nkx2.5和结构蛋白MLC2v在诱导前后均未见表达（图2）。# o6 Z8 Q( a4 e3 X; z
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　　2.3诱导前后hMSCs细胞染色结果

诱导前后单个hMSCs的胞浆内存在散在排列无序的αactinin荧光，而相邻细胞之间可见Connexin43荧光（图3）。

　　3讨论

UCB作为造血干/前体细胞移植治疗血液恶性病的主要细胞来源已被大家广泛接受。近期从UCB中也分离出具有自我更新能力和可塑性的MSCs。尽管BM来源和UCB来源的MSCs有相似的分化潜能，但是也有很大的差异[3，4]，研究表明UCB中含有一种表达胚胎干细胞标记物的间充质干细胞克隆[5]，具有较成体MSCs更强的分化潜能，这点已从向骨系的分化得到证实[6]。本实验拟验证UCB来源的hMSCs体外向心肌细胞转分化的能力。RTPCR结果表明诱导前的hMSCs就可表达心肌早期转录因子MEF2C和心肌结构蛋白Connexin43及αactinin，这说明MSCs具有启动心肌细胞方向转化和形成缝隙连接的潜能。经5aza诱导后，上述基因的表达均有不同程度的增强(图2)。更主要的是，诱导前的hMSCs并不表达心房特异性基因MLC2a，而在诱导后的4个组中出现了MLC2a的表达，且与5aza诱导水平和时间有一定关系。相反GATA4 、Nkx2.5和MLC2v始终未见表达。在心脏发育的分子机制中，细胞因子、激素、药物（如5aza）等可通过信号途径作用于MEF2C、GATA4、Nkx2.5等早期心肌家族转录因子，从而启动心肌特异性基因的表达，在心肌发生中相互作用，形成调控网络。然而本实验从蛋白水平验证Connexin43及αactinin的表达，hMSCs的胞浆内和相邻细胞之间仅见存在散在排列无序的αactinin和Connexin43荧光。说明hMSCs尚未构成肌节和缝隙连接结构，更不能实现心肌细胞规律性的舒缩功能。
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本实验观察到在较高水平5aza的作用下，细胞增殖速度呈现与水平相关的减慢，并可见少许细胞胞浆内有脂肪空泡，以12 μmol/L组为多，说明化学诱导物5aza具有一定的细胞毒性。另外经过十余次传代的 hMSCs在接种密度较高时生长迅速，接种密度较低时（5000/cm2）细胞的增殖较慢，融合仅达50%左右，形态也由均一密集的长梭形转变为短宽的单个不规则状，并见到少许细胞有双核。提示hMSCs本身之间可能存在相互作用，细胞密度对扩增和分化有一定影响。
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很多实验报道从动物BM中提取的MSCs经诱导后，从基因、表达蛋白、超微形态上表现心肌细胞特点，并可得到具有自律性搏动的细胞。与这些文献相比,本实验UCB分离的hMSCs在心肌分化方面似乎不存在优势。这需要更多的背景分析：（1）首先已有研究者对这些实验提出质疑。组织学判定胞质内有肌节结构且细胞核位于胞体中心的才是真正的成熟心肌细胞，但是在培养条件下演变成符合上述金标准形态的心肌细胞的极少，而且很难重复，大部分的研究手段不足以说明所分化的细胞就是真正的心肌细胞。（2）许多实验中MSCs在诱导后才表达心肌早期转录因子如MEF2C、GATA4 、Nkx2.5等或心肌特异性基因。而本实验的hMSCs在诱导前就有MEF2C和结构蛋白Connexin43、αactinin的表达。需注意的一点是，本实验选择的是P11的MSCs，经过多次传代的hMSC与P13代的细胞在心肌分化和对诱导的反应上可能存在不同。有研究表明BM来源MSCs在传代十余次后出现衰老现象，而对UCB来源hMSC这方面观察尚不足。（3）在分化机制方面人和动物有很大差异，人的心肌分化机制更为复杂。例如人胚胎干细胞的心肌分化率就远远低于小鼠。因此动物MSCs和hMSCs的转分化能力也不同。（4）最后，对hMSC这类细胞的表面标记物和本身生物学行为的了解还远远不够。馈赠本实验细胞的Saitta小组验证了即便是同一样本的UCB中也可存在两种生物学特性完全不同的的MSCs亚群，并与BM来源的MSCs比较，发现三者具有不同的发育途径基因由此推测在心肌分化方面，三者可能存在不同，而本实验只是初步探讨了其中一种MSCs亚群的心肌分化潜能。因此进一步鉴定MSCs并了解其增殖、分化的必要条件及调控机制是未来主要的研究目标。而在掌握详尽的实验资料之前，hMSCs的临床应用应该慎重。
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