求助脐带间充质干细胞原代方法

wshzhoum

最近在尝试取脐带间充质干细胞原代，有如下问题请教：
' T* i+ w* ~$ j' L/ n    1，脐带间充质干细胞是不是来源于华通胶，取原代时是不是就是将刨除动静脉和羊膜的剩下胶体状物质剪成1x1mm大小组织块进行贴壁* s" Z+ }5 b, G( P% L2 _  L
    2，贴壁时的大概密度是多少？组织块修剪得时候需不需要泡培养基？5 a  |# h  b3 y5 b4 S( O, F7 T
    3，华通胶大多都黏黏的，怎样处理才能贴壁较牢？大家一般让其贴壁多久后加培养基？
6 x5 g" u( t; {; c    4，大概用组织块贴壁法多久能收获第一代细胞。尝试过两次，但组织块现在都飘了，也没有见到细胞爬出......1 L3 Y7 f* ~" E9 H$ u
希望各位高手赐教~不胜感激

feifa1314

同求~

烂桃

回复 1# wshzhou
! b1 j9 b+ B/ ?- m我现在也在做这个，条件摸索的也不成熟，和大家交流下我做这个的心得。说先我觉得脐带分离动静脉容易，剥离羊膜有点困难；由于有组织块，贴壁密度不要太大，组织尽量剪碎，加入血清、双抗及少量培养基；用培养瓶样的话我基本是过夜在翻瓶，首次培养液不要加太多，以免把组织块冲起。我做的原代大概需要10到14天能收获一代，但不纯，需要传代。

wshzhoum

回复 3# 烂桃
; n: R; a+ I5 T% L6 t& q2 [" H' M0 o0 D2 b: V' D7 P

" V! u. w; o& H0 F$ E  ?' `, x- k    组织块之间的间距你大约控制在多少啊？第一次取原代时，组织块还能看见两个细胞趴出，但后来又消失不见了，渐渐组织块也开始漂了～还有就是剪碎的组织块胶多不多，我们现在是用组织块浸泡后１２加培养液，可现在基本不见细胞爬出～请教！

烂桃

回复 4# wshzhoum
+ M& m/ P5 b& ]
2 ~; Y+ X" B5 z& E0 e! o+ N& J. U* m/ ]$ ~* h2 O' X, i/ e
    我是剪碎过后加培养基和血清，大概300-400微升铺一个小培养瓶

xiegm

参考下这个吧" @) R( E' p; a9 s  t3 ~( _: J& Y  s
from In Vitro Cell.Dev.Biol.—Animal (2009) 45:573–576: Q: f' v* R; R: [- |+ P: b
To isolate stem cells, umbilical cord samples' T; o; Y0 ]9 y& E4 Y. |
were rinsed in 75% ethanol (Sigma, Poole, UK) for 30 s; v+ n9 Q! @2 i. A) O, m0 j) [
and cut open in parallel to umbilical cord vessels, so as
5 M4 ^5 U8 |0 O4 x/ Bto expose them fully. The gelatinous tissue surrounding) J' @) c6 p  R, h* Z+ K0 E
the vessels was excised and minced into very fine pieces
1 S6 C6 ~3 H4 @5 o: bof 0.5–1 mm2, which were plated on a sterile 100×20 mm% ~6 \" r1 h0 o9 J8 Q4 D3 _
petri dish (Corning, Ewloe, UK) and left for 5–10 min at5 j; x: A3 o( L! Y
room temperature, to facilitate tissue attachment. The2 Q2 j5 ~% g& b
minced tissue was carefully covered with 5 ml of growth* m; s6 L& U3 g4 x! e: z$ A
medium comprised of low-glucose DMEM supplemented$ C5 X9 `1 X! P3 ]- X6 y! i  J4 u2 s
with 10% foetal bovine serum, 2 mM L-glutamine,
- K/ Y. d$ O6 [penicillin (100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml) solution,
, D2 @# n% y# I: z& E# v# q: C) l25 μg/ml Fungizone, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor
2 a" G' f! I6 Wand 5 ng/ml epidermal growth factor (all from Invitrogen,
( P7 \8 A6 c8 P8 I' MPaisley, UK). WJ samples were incubated at 37°C in a! l% w4 D7 K) m1 ?
humidified CO2 incubator for 5–10 d, before visible colonies$ b' K- _* m. N4 R" O0 m: M
of WJ HUMSCs were observed.

香瓜瓜

羊膜的剥离确实有难度，而且很容易把胶层也损耗掉。所以不用强求羊膜的剥离程度。贴壁时间主要看种的时候组织块粘稠度了，我不加培养基或pbs稀释，原代时间挺长，大概要16天，不排除有某些细胞已经老化的可能。所以消化法如果成熟的话是个不错的选择。

zsc78

只要把3根血管剔除就可了，剥离羊膜比较难，我没有剥离，培养的效果还不错。就是原代需要的时间比较长。

wshzhoum

回复 5# 烂桃 3 X/ O0 R) Y4 G) |
, v+ p2 F4 i0 R' B( \1 b6 @- M3 T$ Z
1 H+ R# H- f3 Q
好的~再重新试一下~万分感谢~