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干货,多能干细胞冻存/解冻标准流程!

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发表于 2018-10-18 16:49 |显示全部帖子
本帖最后由 加拿大STEMCELL 于 2018-10-18 16:57 编辑
; q9 m$ D+ z. `' [' i3 h1 U) {: F, |9 `2 u1 D6 T6 L% w, Y3 Y. Y
多能干细胞的冻存和解冻
" ]% K2 J; x' J: a! Y% v6 F  W3 `2 N" m9 E
上期hPSC维持培养专题的微信我们介绍了如何对mTeSR™1培养的人多能干细胞进行传代。在mTeSR™1维持培养的人多能干细胞可以用mFreSR™Cryostor® CS10进行聚集体冻存,也可以用FreSR™S进行单细胞冻存。这两种冻存方法都可适用于使用聚集体传代技术进行的常规传代。我们推荐使用聚集体冻存hPSC,可以最大限度的保证细胞的活力和核型的稳定,作为hPSC维持培养专题的最后一期,今天我们就来重点介绍细胞聚集体冻存和解冻的标准化流程:& }5 f+ w) G( G4 _* h
5 ~+ D, k$ t+ a9 d- \. W. D
解冻复苏方案适用于在冷冻保存之前在mTeSR™1中维持培养的人ES和iPS细胞。对于其他方案培养的细胞(例如使用饲养层细胞或其他条件培养基,或无饲养层培养基如TeSR™E8™或TeSR™2),应当使用冷冻保存之前相同的培养基和条件下进行解冻。复苏后,细胞可以转换到mTeSR™1培养基。
* ]' Y) Q2 F; ?5 A7 H. O
1 a& l  g# x& u" \: W5 R9 XmFreSR™(产品号 #05854)是一种成分确定、无血清的冻存液,专门为在mTeSR™1中培养的人ES和iPS干细胞设计。为即用型且含冻存保护剂。% ]; x% K, S4 t! A9 ]( g* }

' n! B' Y8 {- O- b  T2 s图1. 与其它已报道的方法相比,mFreSR™的复苏效率提高了5-10倍
8 D) A6 D# L9 Q( E/ u; n6 g$ J: A
+ B( F( l- ^: Z使用mFreSR™冻存如图所示代数的H9 hESCs。复苏效率使用复苏后存活的克隆计数分析。
8 _  b4 \7 Q5 h, B) l
9 c2 o8 j- S7 C% o1 b* RCryostor® CS10(产品号 #07930)是一种无动物成分的广谱细胞冻存液,cGMP级别,为即用型且含冻存保护剂。7 `7 Y! A% m; V; V6 B% g, Z. k

. {8 k  ~" k% J' e$ g: }0 Z3 e1. 冻存
+ h- `0 W& Y4 _2 Q" O& C5 ]3 x2 \, _
注意:开盖之前,用70%的乙醇或异丙醇擦拭瓶身。
  s, ~# P/ f. c; Y) J
% S  S) t9 D, {1 s/ _0 N以下说明适用于在mTeSR™1中培养的6孔板培养物的冻存,使用mFreSR™ 或CryoStor® CS10皆可。培养物应该在适合传代的时候进行收集和冻存。每管所含有的细胞应当来源于6孔板的1个培养孔。如果使用其他的培养器皿,请相应的调整体积。. Q- J: ^4 q, ?# O  m$ E# _
* Z9 H  E/ h4 h. J6 S4 @
注意:如果使用mFreSR™,融化所需量的mFreSR™然后放置于冰上。
" |, I/ t! M1 m$ ]# C) j6 {! T% p
3 g: x, ^5 J; \" I$ H* t/ y(1) 用无酶方法进行传代至第8步,或者用有酶传代方法至第10步。/ D2 P, }( B9 d" i
(2) 在室温(15 - 25°C)以300 x g离心5分钟。& @5 S; R0 H0 ~" E  a# d
(3) 轻轻吸走上清液,注意不要扰动细胞团。1 A) \. g# k( g7 ?6 p; b
(4) 用血清学吸管以1 mL的mFreSR™或CryoStor® CS10重悬细胞。在打散细胞团时,尽量减少细胞聚集体分解。; f5 w7 k0 a6 c' U
(5) 用2 mL的血清学吸管将1 mL的细胞聚集体转移到标记好的冻存管中。! z- a" a4 c$ T" t5 G! X3 Y% G
(6) 用以下方法冻存细胞聚集体:- p0 X) p5 ]' ?9 |: Y9 \) o2 N0 M- D) o
  • 推荐使用缓速降温方法,每分钟降低1度,随后可以在 -135°C液氮或更低的温度长期保存。 不推荐在 -80°C长期保存。
    7 b9 ^7 ?9 H# C  t% j+ Y8 H
- Y1 p- t, u) q: z) r, W
  • 逐步降温法:-20°C保存2个小时,然后 -80°C中保存2个小时,随后可以在 -135°C液氮中或更低的温度长期保存。
    * j7 y0 Q, x) w3 p' R

7 f/ {1 r/ k9 p  X* H- Z( D/ ~2 [+ \
2. 解冻
& Q' r8 r4 b4 X' g8 c6 b, c1 ?3 J( |. p$ p
人ES和iPS细胞在解冻后,应该立即铺板在预先包被好的培养皿中。上述冻存的一管细胞可以成功的铺板到6孔板的 1 - 2孔。
7 i+ L- x% G4 v  D$ V
. o- n: F* ^7 V2 M(1) 开始之前,提前准备好以下材料:试管,恢复到室温的mTeSR™1(15 - 25°C),及预先包被的培养板,确保整个解冻复苏程序可以在最短的时间内完成。
) Z, }7 ?, P' F3 ^注意:不要在37°C水浴中加热mTeSR™1 培养基。6 z8 m5 m9 |$ h% W
(2) 在37°C水浴中快速解冻,持续温和的在水中晃动冻存管,直到剩余少量细胞还处于冻存状态。* |/ J! k6 s- j8 [  c
(3) 从水浴中取出冻存管,用70%的酒精或异丙醇擦拭除菌。
- ]$ m$ o3 Z3 ?) z5 B& q(4) 用2 mL的血清移液管把细胞悬液转移到一个15 mL的锥形试管。+ Q; B( c' ^6 U- b  g
注意:用2 mL的血清移液管代替1 mL的枪头可以减少细胞聚集体的分解。
  f9 f+ e8 c, X9 w- x(5) 逐滴加入5 - 7 mL的预热的mTeSR™1培养基到15 mL的离心管中,加入的同时轻轻混匀。
1 e' _6 |  r; e# Y3 z(6) 室温(15 - 25°C)以300 x g离心5分钟。
( S& z1 ?6 V3 S- v" ?(7) 吸出培养基,使细胞沉淀完好无损。 使用2 mL血清移液管轻轻将细胞沉淀重悬于1 mL的mTeSR™1中。小心保持细胞作为聚集体。0 {. Z. J1 }2 @7 p# H
(8) 将0.5 mL的细胞混合物转移到含有mTeSR™1的预包被的6孔板的培养孔中(例如,每个冷冻管可以铺板两个孔)。
" ]/ k5 b( v/ E: @注意:铺板多少孔可能需要根据冻存的细胞聚集体数量进行调整。通常在复苏后,要比在常规的传代铺板更多的细胞聚集体数量。
0 Y+ R. p: p" _7 \! `+ ^4 ^(9) 将培养板放入37°C培养箱。快速前后左右的摇晃培养板数次,将细胞聚集体分布均匀。24小时内不要移动培养板。
6 X+ n0 n! ]- Z+ O/ t7 D5 H注意:不均一的聚集体分布可能会导致人ES和iPS细胞分化增加。
2 O, P' }4 {! o" w2 m7 ~(10) 用mTeSR™1每天换液,目测培养物以评估生长状态直到下一次传代。解冻复苏后的6 - 7天,查看是否有适合传代的(中心致密的)未分化的集落。
8 Z  c0 D: `. X; Z  K; D注意:解冻复苏后如果只能观察到少数的未分化的集落,只选取这些未分化的集落进行传代,并将它们铺板至相同大小的新包被的培养孔(不进行稀释传代)。1 z! c5 I3 A% K/ \; {

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1 z  k) z) Y: P- P# ?欲了解更多有关干细胞培养的相关内容,包括如何使用FreSR™S进行单细胞冻存/复苏,请参考我们的技术手册:在mTeSR™1中维持培养人多能干细胞。您也可以点击这里申请纸质版操作手册。想了解更多关于多能干细胞的知识?您也可以点击这里申请我们与Nature Reviews Molecular Cell Biology合作的精美挂图 - Stem Cell States - Naive to Primed Pluripotency。1 o) _( w+ R/ C: y* }5 B2 L* V
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