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干货,多能干细胞冻存/解冻标准流程!

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发表于 2018-10-18 16:49 |显示全部帖子
本帖最后由 加拿大STEMCELL 于 2018-10-18 16:57 编辑 . w* W( Y) ~& G' E+ g9 l+ {- c

) g% z6 G4 S7 [4 R. Z  l2 {3 ]多能干细胞的冻存和解冻
) ~9 r; K5 W. c7 D9 K* n: O0 o  k$ y
上期hPSC维持培养专题的微信我们介绍了如何对mTeSR™1培养的人多能干细胞进行传代。在mTeSR™1维持培养的人多能干细胞可以用mFreSR™Cryostor® CS10进行聚集体冻存,也可以用FreSR™S进行单细胞冻存。这两种冻存方法都可适用于使用聚集体传代技术进行的常规传代。我们推荐使用聚集体冻存hPSC,可以最大限度的保证细胞的活力和核型的稳定,作为hPSC维持培养专题的最后一期,今天我们就来重点介绍细胞聚集体冻存和解冻的标准化流程:
, P6 ]: w0 p  o; j# U( M7 B* O8 z; C0 }: [1 `* @
解冻复苏方案适用于在冷冻保存之前在mTeSR™1中维持培养的人ES和iPS细胞。对于其他方案培养的细胞(例如使用饲养层细胞或其他条件培养基,或无饲养层培养基如TeSR™E8™或TeSR™2),应当使用冷冻保存之前相同的培养基和条件下进行解冻。复苏后,细胞可以转换到mTeSR™1培养基。1 Z5 L& ?* R7 d
* t, @8 r* T5 w
mFreSR™(产品号 #05854)是一种成分确定、无血清的冻存液,专门为在mTeSR™1中培养的人ES和iPS干细胞设计。为即用型且含冻存保护剂。, y- G. X1 D  G5 s. Y, ]% {

7 e: \, C( t3 C1 R+ w图1. 与其它已报道的方法相比,mFreSR™的复苏效率提高了5-10倍 0 i' n4 X0 H/ B
: ~: b7 }4 @& [& k+ S  a' _1 r
使用mFreSR™冻存如图所示代数的H9 hESCs。复苏效率使用复苏后存活的克隆计数分析。
4 ^( Q. R' {- u' d' l& T
5 q; l, s' D1 s7 w; @7 eCryostor® CS10(产品号 #07930)是一种无动物成分的广谱细胞冻存液,cGMP级别,为即用型且含冻存保护剂。8 V( i2 z& |) C8 F! `! v0 n

# U, E- v3 i3 \% j+ [5 v6 p+ V9 p1. 冻存) W9 N, E0 t7 N' o
2 p9 \# c, {0 W* p, e' z' M* y
注意:开盖之前,用70%的乙醇或异丙醇擦拭瓶身。, G6 o5 P; O2 D! w% F" W0 U# e
: C& l, O. C! W/ G9 G5 W1 A
以下说明适用于在mTeSR™1中培养的6孔板培养物的冻存,使用mFreSR™ 或CryoStor® CS10皆可。培养物应该在适合传代的时候进行收集和冻存。每管所含有的细胞应当来源于6孔板的1个培养孔。如果使用其他的培养器皿,请相应的调整体积。. H; @9 j. N  O2 @5 I" S2 o! [( m
, V3 \* l% j$ K3 R; D/ T
注意:如果使用mFreSR™,融化所需量的mFreSR™然后放置于冰上。
* \$ C" i6 j6 l8 ~0 a5 X- S3 X
, o/ X# J/ ], r4 r(1) 用无酶方法进行传代至第8步,或者用有酶传代方法至第10步。
, r  {' U& [/ u3 O(2) 在室温(15 - 25°C)以300 x g离心5分钟。# J% r5 P  i  }
(3) 轻轻吸走上清液,注意不要扰动细胞团。
5 A) i' n. b  Z; W) s% y8 v(4) 用血清学吸管以1 mL的mFreSR™或CryoStor® CS10重悬细胞。在打散细胞团时,尽量减少细胞聚集体分解。
; S4 v: _% W$ e1 V- {+ J' Y(5) 用2 mL的血清学吸管将1 mL的细胞聚集体转移到标记好的冻存管中。( o0 H  Y8 \% [/ }* e
(6) 用以下方法冻存细胞聚集体:
% E9 s, ^- q; Z
  • 推荐使用缓速降温方法,每分钟降低1度,随后可以在 -135°C液氮或更低的温度长期保存。 不推荐在 -80°C长期保存。
    2 I$ y$ a* K1 s
9 ^! |4 P% p* f; I; n9 l
  • 逐步降温法:-20°C保存2个小时,然后 -80°C中保存2个小时,随后可以在 -135°C液氮中或更低的温度长期保存。
    $ \* c0 \3 p5 r: l) n+ p

0 ^$ O) r- _0 `% A: j- k8 X2 t7 L7 C: t; u+ a" R
2. 解冻$ N/ \! @4 ^0 I9 P4 i9 S

& X5 j8 K* C7 @  Z; X人ES和iPS细胞在解冻后,应该立即铺板在预先包被好的培养皿中。上述冻存的一管细胞可以成功的铺板到6孔板的 1 - 2孔。
$ Y( x+ b, J% a' a/ Y5 {$ l, _7 m
(1) 开始之前,提前准备好以下材料:试管,恢复到室温的mTeSR™1(15 - 25°C),及预先包被的培养板,确保整个解冻复苏程序可以在最短的时间内完成。
% D0 Z0 d7 @; f; E0 D注意:不要在37°C水浴中加热mTeSR™1 培养基。
! R/ I% W: K" H0 F(2) 在37°C水浴中快速解冻,持续温和的在水中晃动冻存管,直到剩余少量细胞还处于冻存状态。
/ q# a# c' ]4 z$ m1 ^7 g(3) 从水浴中取出冻存管,用70%的酒精或异丙醇擦拭除菌。5 [7 f( Q6 M; K
(4) 用2 mL的血清移液管把细胞悬液转移到一个15 mL的锥形试管。: x% Z. x# P/ J$ G9 Q3 j
注意:用2 mL的血清移液管代替1 mL的枪头可以减少细胞聚集体的分解。
8 t7 ]8 p3 o; Z! u2 z4 Q(5) 逐滴加入5 - 7 mL的预热的mTeSR™1培养基到15 mL的离心管中,加入的同时轻轻混匀。. y& c, X3 `9 ]1 t) A# b4 v9 {1 B
(6) 室温(15 - 25°C)以300 x g离心5分钟。
: G, y' w1 M7 T8 _) G4 l% s(7) 吸出培养基,使细胞沉淀完好无损。 使用2 mL血清移液管轻轻将细胞沉淀重悬于1 mL的mTeSR™1中。小心保持细胞作为聚集体。
3 C. ]! C) l  Y  C* k: J(8) 将0.5 mL的细胞混合物转移到含有mTeSR™1的预包被的6孔板的培养孔中(例如,每个冷冻管可以铺板两个孔)。
" g$ Q# r! m' t- O* z: ~7 B注意:铺板多少孔可能需要根据冻存的细胞聚集体数量进行调整。通常在复苏后,要比在常规的传代铺板更多的细胞聚集体数量。
1 V* [0 Q/ Q+ l(9) 将培养板放入37°C培养箱。快速前后左右的摇晃培养板数次,将细胞聚集体分布均匀。24小时内不要移动培养板。
9 _# ~( \/ u; N4 J# W7 m, P注意:不均一的聚集体分布可能会导致人ES和iPS细胞分化增加。3 m2 p0 q+ Q# h4 I
(10) 用mTeSR™1每天换液,目测培养物以评估生长状态直到下一次传代。解冻复苏后的6 - 7天,查看是否有适合传代的(中心致密的)未分化的集落。; I( k" Z+ V1 y9 B- Y
注意:解冻复苏后如果只能观察到少数的未分化的集落,只选取这些未分化的集落进行传代,并将它们铺板至相同大小的新包被的培养孔(不进行稀释传代)。. j4 ^# R8 d3 K

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4 k* d* O6 B6 x/ `8 m' F欲了解更多有关干细胞培养的相关内容,包括如何使用FreSR™S进行单细胞冻存/复苏,请参考我们的技术手册:在mTeSR™1中维持培养人多能干细胞。您也可以点击这里申请纸质版操作手册。想了解更多关于多能干细胞的知识?您也可以点击这里申请我们与Nature Reviews Molecular Cell Biology合作的精美挂图 - Stem Cell States - Naive to Primed Pluripotency。
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