如何将胚胎干细胞和支持他生长的饲养层分离开来？

mominglily

对胚胎干细胞做毒性测试，怎样将胚胎干细胞和支持他的饲养层细胞分开，以使加到96孔板中的细胞是纯粹的胚胎干细胞而不夹杂较多的饲养层细胞？8 W3 ]% U" d0 u- b
请教各位，谢谢！

待鹤

使用MEF来源的条件培养基代替feeder。: r4 ^1 p) V. M2 Y, m9 x6 b/ y
条件培养基制作方法如下：) p- k3 b- P4 H0 g$ P- P
Preparation of MEF- Conditioned Medium (MEF-CM)& {& S8 C, Q9 D' w& d, |
1. Plate 4 x 106 mitomycin C treated MEFs in a T75 Flask coated with 0.5% gelatin, in complete MEF medium.9 u! r- I- {+ y: c
2. The following day, replace the MEF medium with 37.5 ml 20% KSR hESC medium containing 4 ng/ml bFGF, and incubate for 24 hrs at 37°C, 5% CO2.* \9 C. R" e0 r+ k( h. E
3. Collect MEF-CM from the flasks after 24 hrs and 0.22 μM filter sterilize. MEF-CM can be used fresh or can be frozen.
. A. X( b& e+ X# A0 a- y4. Add fresh 20% KSR hESC medium containing 4 ng/ml bFGF to the flasks.
- f/ d0 ^& c: g$ C5. Collect MEF-CM for up to seven days using this procedure.
1 M6 H4 j$ \9 f* Z* d6. Depletion of L-Glutamine and bFGF from the MEF-CM is assumed, and L-Glutamine (to 2 mM final), and bFGF (to 4 ng/ml final) are therefore added back prior to using MEF-CM with hESCs. Freshly thawed ß-Mercaptoethanol (ß-Me) is added to 0.1 mM final fresh each day of use.

待鹤

这儿还有Nature上的一篇protocol。  Z/ {3 ~) r' ?& r- A- q. A8 O
Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.pdf
1 E4 u+ a4 \. p6 i6 B

mominglily

万分感谢，我先下载来学习下，但是目前我们在做的是含有饲养层的mES细胞，就想寻找针对有饲养层细胞的方法。

czzhaozhu

对于mES细胞和MEF feeder如何分开来，我们实验室一般采用差速贴壁的方法，MEF feeder1h左右在明胶包被的皿上有70-80%贴壁，而ES细胞基本不贴。

mominglily

回复 5# czzhaozhu ) v3 B" S7 O. S5 B, t7 X( @
8 @3 L6 h( w$ z

! K3 b: Y  c9 `1 O    谢谢您！我自己也打算用这种方法来做，但是是否必须选用和原板面积一样大的板来爬呢？用较小一点的面积的板可以吗？！~还有就是爬的时候需要加凝胶铺板还是空板？因为有人说使用空板来爬，谢谢！~

冰罗布

谢谢，学习了

blue11sea

应该使用空板来爬，因为有明胶ES也容易贴

blue11sea

MEF贴壁速度和明胶关系不大吧

可怜的孩子

“对于mES细胞和MEF feeder如何分开来，我们实验室一般采用差速贴壁的方法，MEF feeder1h左右在明胶包被的皿上有70-80%贴壁，而ES细胞基本不贴。”, x- d: n" i5 `, @# |1 A$ f

3 c9 O5 j, O. L4 G  p丝裂霉素处理过的MEF吗？