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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-17 15:56 编辑
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第三天中午，差不多复苏后50小时左右，观察细胞
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" j* A3 U9 Q% `9 w* ^& a' o
k$ E+ i) _. b! |不同的实验室消化传代的方法不同，我的方法可供参考：
0 P/ q' a' `: N4 i$ M4 w! W$ }1 T! G: z' g; K7 Y, d" |
实验前准备：0 E Y# |2 y' h: V- M5 c* a% I) s
（1）DMEM+10%FBS# B+ x/ X2 M3 L9 v- \
（2）PBS3 Q! e ~: h3 g5 ], ~( d& F$ s
（3）0.25%胰酶1 {; |% J: u4 R0 Z, |- Q
（注：同样这些试剂要平衡到常温再做实验）" U$ ~* B }2 E) w
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实验步骤：, F: E \% s: G3 q$ w& _
（1）弃去T75瓶中的原液。0 R6 i2 X, N, q+ e# y# u7 J
（2）加入5mlPBS洗一遍，洗去残留的血清。& ^2 f: ^- J( |
（3）加入3ml胰酶，大概常温放置1-2min。
9 n& A9 F& r$ B（4）加入6ml新鲜培养基中和胰酶，并轻轻吹打内壁上的细胞。
: u3 D) u( P8 o4 m+ Q（5）将内壁上的细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大，3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧，呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧，也有人吹打5-10min。5 d5 y5 b2 P. g' i4 J
（6）吹打成单细胞悬液后，转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。
2 V8 H" l; f3 T2 `2 S# }（7）离心期间另外准备两个T75瓶，加上原瓶，共三个T75培养瓶，分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后，用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后，平均转移至三个T75瓶中。混匀。
* x- ` ]0 j5 D" u（8）放入温箱培养。; U9 B% H' W( b$ M+ r
(注：我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶，也就是1：3传。) |
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发表于 2009-8-17 15:46
发表于 2009-8-17 17:04
