RT PCR

sailboat

看到很多关于RT-PCR的求助贴，而且都是围绕那么几个问题。先做个总结，不足之处请各位大虾补充。希望能够抛砖引玉，呵呵。7 `) M- K6 D1 h
1.RT-PCR时，内参能出来而目的条带不出来的可能原因：# m4 i" }. c  E9 _& ~
(1)RNA部分降解了。很多人都把内参作为判断cDNA模板质量的一个非常重要的标准，认为内参能出来那么cDNA一链质量肯定没问题。但我一直都认为，内参能P出来，仅仅只能说明RT成功了，但与cDNA一链的质量并没有必然的联系。因为内参片段大小一般都比较小，而且表达量也比较高，在反转录时比较容易成功。而目的基因因“基因‘而异，大小与表达量都存在很大的不同。特别是长于2kb的目的片段时，更是不能仅仅根据内参来判断cDNA质量。我现在做RT-PCR，都喜欢把以前能P出来的目的片段来做内参，以此来作为判断cDNA质量心里更安稳些。
2 `/ i8 |# N  L: M' h(2)如果RNA质量很好，那可能是反转录的效率问题，特别是长片段。一般情况下，我们现在用的反转录酶有M-MLV，AMV，PrimeScript(TM)等。在延伸能力上，个人觉得M-MLV<AMV<PrimeScript(TM)。用AMV的做反转录，最长的也就P过2.2kb的片段，用PrimeScript(TM)有P过3kb的，更长的没试过。如果目的片段在1kb左右，三者的效果差别不大。反转录效率除了和试剂有关，还和样品有关。比如有些样品带有复杂的二级结构，或者富含GC，或者有些样品很珍贵量很少，都要根据自己的目的片段大小和样品的情况选择合适的反转录酶。另外，在反转录时，所用的引物有Oligo dT、Random 9mers、特异性的下游引物等。这三者的使用各有优缺点。Oligo dT我想是用的人最多吧。以Oligo dT进行反转录可以得到一些都含有具有poly(A)尾巴的长短不一的cDNA一链；以Random 9mers进行反转录可以得到一些长短不一，序列各异的cDNA一链；以特异性的下游引物进行反转录可以得到一些都含有特异下游引物序列的cDNA一链。就其反转录效率而言，我觉得Random 9mers最好。因为它没有针对性，可以合成许多不同的序列，可以满足不同的人对不同基因克隆的要求，但也正是其没有针对性，会造成cDNA一链序列过于复杂，PCR时容易出现杂带；与此相对的就是以以特异性的下游引物进行反转录的，得到的模板对于特异的基因而言很纯，但也就只能满足某个人的要求，而且这种特异结合的效果不佳（具体原因不详）。剩下的Oligo dT的效果就在上述两者之间。有一点需要说明的是：如果引物序列靠近poly(A)尾巴，建议选择Oligo dT为引物；相反，选择Random 9mers为引物。
/ y9 ~& n) X2 T+ ^(3)如果上面两个都没问题，那么最有可能的是引物的问题了。很多时候，大家都会怀疑自己P不出来是PCR反应条件或者是反应体系的问题而不是引物的问题。或者是我自己对引物设计不是很有信心吧，反正当我RT-PCR出不来的时候我就会怀疑自己的引物问题了。介绍个经验，大家可以参考一下。一般情况下，低保真性的酶比高保真性的酶更容易p 出条带，即使有杂带，但只要能把目的条带P出来就有希望。但是如果连低保真性的酶都P不出目的条带，高保真性的酶更不容易p 出来。只有当模板具有复杂二级结构的或者是目的片度富含GC时，试剂和PCR反应条件（比如热启动、touchdown或者使用针对富含GC片段的Taq酶）这个时候才起至关重要的作用。只有当目的条带能p 出来的时候，再调整PCR反应条件和反应体系才有意义。
% {1 f2 N* i6 `% ~2.RT-PCR时，内参不能出来的可能原因：. N# Z( y$ k& C4 f$ [3 G; D
(1)RNA是否降解严重？RT是否成功？一般情况下，出现内参都p不出来的很多时候都是RNA降解严重导致的。另一个可能原因是逆转录失败。上面说内参不能作为判断cDNA一链质量的标准，在RNA质量没问题的情况下却可以作为判断逆转录是否成功的标准。逆转录技术现在都很成熟了，一般情况下只要按着试剂盒的说明书一步步做下去不会有什么问题的。
; l$ y( F0 m- L* h* v对于初学者，有几个地方需要注意的：反转录一个小时，有些人喜欢放在水浴锅中，有些人喜欢放在PCR仪上，有些人喜欢放在恒温箱中。不管放在哪里，最重要的是要保持一个恒定的温度和恒定的反应体系，以提高反应效率。我觉得PCR仪上的效果最好（做过一回，但觉得一直停留在一个温度对仪器的损耗很大）。PCR仪有热盖温度，可以有效防止蒸发（限进口管子，国产的还是很容易蒸发。如果用国产的管子，建议还是放水浴锅中）；其次是放水浴锅中的；再次是放恒温箱中的。如果把逆转录反应体系放在装有水的盆子中然后再放入恒温箱中，效果与放水浴锅中的差不多。（以上这些均只是我一次的实验对照，而且实验结果还可能与实验室的仪器的精密度相关，所以这些仅供参考。最好是按各自实验室的原有的基础或习惯做）
& U! b8 j1 H" H(2)P内参的引物是否可靠？PCR所用的试剂有没有问题?判断是否是PCR所用的试剂有问题，只要做一管一定能P出来的东西就可以了。$ K7 z0 H  m0 h4 I4 I
3.RT-PCR时，内参不能出来而目的条带能出来的可能原因：5 E) s* `/ B9 s
这种原因很少见，最大的可能就是用于p 内参的引物出问题了。