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1．制胶及上样：+ N b. I4 T( C- B# ~
（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。6 m; q* P- y. H2 _9 |
（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。待胶完全聚合。
' Q5 K- X8 L4 u4 y2 {（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。
: P3 l: K2 g. Q- @（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。& i% M/ }/ u1 B' f& i: g" j# _
（5）分别取50μg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5′样品缓冲液，以1′样品缓冲液？配平上样体积（总体积20μ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。3 Y# n$ i1 q! ]' t' `2 |: t( z" e
（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。$ J4 k8 o6 T5 e* n/ T
2．电泳; d9 B& l6 Y$ W1 |& v* v, v
（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。（约30分钟）
0 H2 H( r& x! b3 D（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。（约60分钟）
' g% o& ]) a1 C* n N7 e4 l3．转膜% e6 T( S- {) @ o4 k" P, ~
（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。8 ?2 }2 ~ I1 S0 z; W3 Z" C
（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。+ x& w) [% y, X+ h6 E8 V9 q( [& s
（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
' [# e4 _4 }, E$ B（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
+ Q+ P. {9 k( b. B4 J4 g4．染色3 |6 b }0 a6 h& g
（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。
/ R* ]# z; ?; o. m& y（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。
* T8 ?2 X/ [ H& F; z# y' i（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。
, q$ [7 M1 O, F8 Y3 h$ W3 t5．封闭
! P' J2 Y. t3 P# I" _9 g4 i% p# V; C* h* X6 v ^
7 t" y3 ^% g! _把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。
' p$ k1 b' Q* A6．洗膜与杂交
% p6 \" m0 t3 T% j5 F* G2 C3 X（1）以T-TBS洗膜，10分钟′ 3次。, D- |1 ?2 j; N& Q
（2）第一抗体封闭： SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
9 q% G, u2 M3 |, C. f3 _（3）以T-TBS洗膜，10分钟′ 3次。* }1 b5 M: ~/ ^) o9 i" T
（4）第二抗体封闭：辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体（1：4000），按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，室温下振摇60分钟。. `, [* l" |, N: A4 l0 m: t
（5）以T-TBS洗膜，10分钟′ 3次。: }# \! W2 z: E' J" |. w4 B
7．化学发光与曝光/ q- `, \' M; f+ Y+ }" z, x6 d
（1）将化学发光试剂盒中的两种试剂各取0.5ml，按1：1的比例混合，在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1分钟。
& N: H* D/ H) ]. e2 S（2）用滤纸沾干膜上的液体，用保鲜膜包好，用感光胶片在压片盒中曝光约1分钟。+ x2 `4 Q3 P. D0 O5 D
（3）曝光后的感光胶片在显影液中显影约30秒钟，定影液中定影1分钟，用水冲洗后晾干。
1 F- e; a6 q' g, O* x- A: s（4）根据曝光情况调整曝光时间，重复压片、显影及定影，选择满意的胶片。* j6 s2 J1 K7 Z0 Q
（5）重复实验三次。 |
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发表于 2009-6-4 15:20
