专家经验谈：如何用CRISPR编辑iPS细胞

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CRISPR基因编辑和iPS重编程是生命科学领域近十年最热门的两大技术。现在，科学家们正在撮合它们联姻。8 l3 r& k# {; q' y. H$ e

  |' w0 O7 {, E- z4 a干细胞能够分化成为机体内任何类型的细胞，既是研究人体早期发育的理想工具，也是细胞治疗的宝贵资源。胚胎干细胞很适合临床使用，但获得这些细胞会破坏胚胎，有很大的伦理争议。2006年日本科学家山中伸弥开发了一个变通方案，用逆转录病毒将四个转录因子（OSKM）引入特化的成体细胞，再将其重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。这些细胞在实验室中表现出与胚胎干细胞相当的能力，又避开了胚胎干细胞的伦理问题，在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景，被人们视为细胞疗法的新希望。山中伸弥也因为iPS技术赢得了2012年的诺贝尔生理/医学奖。  Y  H7 [* ^) [! Y7 b& \

0 Z& D1 I1 e. WCRISPR是指规律成簇的间隔短回文重复，细菌通过CRISPR与内切酶Cas组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas能根据向导RNA的指引切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。该系统可以简单精确地编辑任何基因组区域，据说新手可在一周内学会用CRISPR编辑传统的永生细胞系（比如HeLa或HEK293）。此外，研究者们还在CRISPR的基础上开发了调控基因表达的新工具。5 y, d- d; M, N0 z3 P* A8 C" G
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人们普遍认为，iPS与CRISPR的结合会起到一加一大于二的效果。举例来说，CRISPR用于人类iPSC可以揭示基因在特定疾病中起到的作用，甚至可以校正患者细胞的基因缺陷。虽然CRISPR-Cas9和人类iPSC在实验室中已经相当普及了，但二者相结合并没有想象中那么容易。The Scientist杂志与多位正在使用这两个工具的专家联系，推出了在人类干细胞中使用CRISPR的基础指南。这份指南对人iPSC和人胚胎干细胞同样适用。
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4 c8 F# ~# I# \% w0 i基本工作流程
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在人iPSC中用CRISPR编辑基因或者控制基因表达，你需要开启两条平行的任务线：1）培养充足且可靠的多能干细胞；2）针对目的基因设计20nt的向导RNA。7 S3 @9 g* e9 @7 C, C
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研究者们目前主要通过电穿孔递送向导RNA和Cas9核酸酶，因为这种方法能在保证细胞存活的同时送入更多DNA和蛋白。你可以在市面上找到自动化的台式系统，比如Lonza的Nucleofector系统和ThermoFisher的Neon系统。Gladstone心血管病研究所的博士后Mohammad Mandegar奉劝大家，如果不是高通量细胞筛选，请不惜一切代价避免慢病毒递送，因为人多能干细胞似乎会天然沉默慢病毒送入的基因。
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6 E$ ~$ ~, l: M抗生素抗性可以帮助我们挑选经过编辑的克隆。研究者们一般将抗生素抗性、荧光报告基因和流式细胞仪结合起来，富集那些转染成功的细胞，把它们铺在单孔或多孔板上。通过追踪细胞形态、多能性标志物和细胞分化能力可以评估细胞的多能性。专家建议每10-20代或者每次细胞操作之后进行核型分析，确保细胞的染色体数量正常。/ ~) h6 F; T9 |' `7 R! A/ ~

# s; o% h2 h* [  M! V9 M- E9 ]iPS细胞系如今有许多购买渠道，各大实验平台和公司都提供有相应的服务。此外，iPS重编程方案也非常多。加州大学伯克利分校的细胞生物学家Dirk Hockemeyer表示，我们应当找到最适合自己的方案，在开始CRISPR编辑之前一定要很好地掌握这些细胞。! V  O: ^0 @* y3 [$ ~. J1 z, \# Z" o
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人多能干细胞VS人肿瘤细胞系2 n3 @/ e: T. C2 W3 A1 B# _

) ^! m- S; d1 p! o  M专家们还建议，在着手iPSC之前先用人类癌细胞系试一试CRISPR-Cas9工具。在对iPSC动手的时候牢记一点：操作人iPSC更繁琐、更讲究也更加昂贵。
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9 N! [$ {# q' F! m( n# T据介绍，有经验的研究者用大约一个月的时间能学会基础的人iPSC培养。由于新方案和试剂经常出现，操作这些细胞是一个不断学习的过程，哈佛医学院George Church实验室的博士后Susan Byrne说。“我告诉本科生，如果在正确的指导下操作这些细胞，你们将在六个月内成为专家。但人们一开始总是低估了这种技术，”哈佛干细胞研究所的Chad Cowan补充道。6 D! T2 R! U! G0 Z3 P$ s
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请记住，每一个干细胞系都是独特的。这会影响细胞培养和向导RNA的效果 。“供体和重编程方法都会带来变异，”Byrne说。“有时我们需要对特定干细胞系进行方案优化。”一般来说，就算细胞系很健康、实验方案很完美，人iPSC和ESC的编辑效率也会比癌细胞系低十倍，Johns Hopkins大学医学院的Linzhao Cheng指出。
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深入了解你的基因
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知己知彼，百战不殆。了解你想要编辑的基因座，认识那些可能转录的序列，可以帮助你设计出最佳编辑方案。举例来说，有些基因在编辑之后仍能表现出一定的生物学活性。在这种情况下，你可能需要切割更大的区域，Byrne说。
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选择多个向导RNA并对它们进行测试。现在已经有很多软件可以筛选向导RNA。不过，就算是特异性非常好的向导RNA也有可能效果不佳，甚至根本不起作用。造成这种情况的原因很多，比如你可能没有足够好的参考基因组。此外，你可能需要优化向导RNA的活性，加州大学圣地亚哥分校的生物工程师Prashant Mali说。他和George Church领导团队在Nature Methods杂志上发表文章，向人们展示了获得活跃向导RNA的通用设计规则。
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将CRISPR应用到iPS细胞中去，可以实现个性化的干细胞治疗，造福多种遗传学疾病的患者。James Thomson与Murdoch儿童研究所（MCRI）合作，将重编程与CRISPR基因组编辑结合到一个步骤中，显著缩短了生成基因校正干细胞的时间，是实现个性化细胞疗法的重要一步。5 X: x. X" _, O8 X5 m( i4 N8 l* t. [

! P+ t  f0 i0 l2014年11月，遗传学大牛George M. Church领导的研究团队在Nature Communications杂志上展示了CRISPR编辑iPS细胞的脱靶情况。他们对人iPS细胞进行CRISPR基因编辑，然后将全基因组测序和靶向深度测序结合起来，鉴定了Cas9编辑iPS细胞时的脱靶效应。研究指出，CRISPR编辑人类iPSC并没有导致显著的基因组改变或突变率提高，不过有一种单核苷酸变异（SNV）会影响Cas9的特异性。
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8 j$ @3 }8 Q9 e) g; }- H0 u7 \敲除VS精确编辑, `% y, ]9 H% |6 J( W2 k
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当你用CRISPR-Cas9切割基因的时候，主要有两个分子通路在执行DNA修复。这两个同时发生的通路决定了基因编辑的精确性。非同源末端连接（NHEJ）负责敲除基因，制造破坏基因功能的小插入/缺失。同源介导修复（HDR）根据供体DNA精确改变核苷酸序列。8 O- U& f2 m; F0 c) g
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不少研究者在进行基因组编辑的时候使用偏向HDR的条件。他们发现，人多能干细胞的编辑效果比传统永生细胞系差，转染100个iPSC只能引入一个正确的改变。这是CRISPR基因组编辑面临的一个主要挑战，不过Hockemeyer觉得自己的团队还能应付。“如果你有很好地组织培养流程，那么挑200个克隆就能获得2个正确克隆。一个学生在三小时内就能搞定，”他介绍道。/ L  M7 j. C  I. W$ W
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Hockemeyer及其同事正在开发新策略，试图让天平向HDR倾斜，比如采用特殊化合物或者其他物种的Cas9。“我认为这个问题很可能未来几年内就能得到解决，”Hockemeyer表示。1 C% l; u3 N( D0 T

! n- ?* t- ^, }9 V: R' YConklin团队开发了一种快速数字PCR测试，用来定量HDR和NHEJ的修复效率。他们的研究显示，在人iPSC和其他一些细胞中，HDR和NHEJ效率之间并没有什么关系。
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验证你的基因组编辑4 J& W6 ?; w6 Y/ a0 i8 a
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如何证明CRISPR系统完成了正确的切割呢？你可以给细胞提供与编辑基因互补的DNA，这些DNA应该能够挽救相应的细胞表型。如果细胞表型变化很小难以观察，你可以尝试再次编辑这个基因，看看能否使其恢复成野生型，Hocke­meyer说。% v( a! _& H9 k
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研究者们也会抽查自己的基因组，比如对编辑区域进行PCR和Sanger测序。免费算法TIDE（tide.nki.nl/; for Tracking of Indels by DEcomposition）可以在PCR和Sanger测序数据的基础上鉴定目标突变及其发生的频率。7 F/ n$ Q# n# i5 e3 C/ S

7 ~9 J8 y: R# k8 p# D4 t外显子组测序将成为验证基因组编辑的首选方法。“测序可能是对你整个系统最完全的分析。如果这个细胞系要用上十年，那么测序就是你应该做的投资。你需要确保一切都尽善尽美，”Mali指出。同时我们也应当请牢记，遗传学差异会随着时间的推移慢慢累积，任何细胞系都不例外。
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7 ~2 t+ Q* ?5 X' b2 {$ d7 X! ?$ Q0 |2 `& ^脱靶效应并非大问题
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针对同一个位点设计两个以上有充分差异的向导RNA，这是防止脱靶编辑一个主要途径。总的来说，脱靶效应对于绝大多数基础研究者来说并不是什么特别大的问题，Cowan认为。CRISPR系统在人多能干细胞中的脱靶效应比癌细胞系少得多，Cheng也表示。但如果真的很担心脱靶，全外显子测序将是你最好的选择。( ^3 X) {; w4 m) y. ?* |3 U
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用CRISPR调控基因表达
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. Y" L. X' q: o, i" |/ P, t( b如果你指望在多能干细胞中敲除多能性必需基因，那你肯定要失望了。因为敲除这些基因会导致细胞死亡。在这种情况下，我们只能选择下调（或上调）基因的表达水平。研究者们为此打造了失去催化活性的dCas9，dCas9能到达向导RNA指定的位点，但无力对DNA进行剪切。用dCas9抑制转录的策略被称为CRISPRi，用dCas9激活转录的策略被称为CRISPRa。/ ^7 X, [4 u3 p: I2 |

# e% ?' `- u% p* p1 _7 v& @今年三月Cell Stem Cell杂志发表的一项研究显示，对iPSC进行功能缺失筛选的时候，CRISPRi比传统CRISPR更为有效。CRISPRi在95%的细胞中沉默目的基因，CRISPR-Cas9只能在60-70%的细胞中关闭目的基因，而且CRISPRi没有发生脱靶。8 t" f8 |- M: y- J% N8 M
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基因表达控制和基因编辑之前的主要区别在于，基因表达控制并非永久性改变基因组。你可以干扰细胞沉默基因，然后再逆转这种抑制。此外，与CRISPR-Cas9相比，CRISPRi和CRISPRa的脱靶效应更小。+ Z7 S- ]7 I0 I# y& }4 }
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CRISPR调控基因表达也存在一定的挑战。举例来说，设计一组可靠的向导RNA很难，Mali说。在理想情况下，向导RNA应当避开紧紧缠绕核小体的基因组区域。但有时候我们想要靶标的位点就在这些区域里。% i: F2 R) Y7 Q' h8 _

# A: S3 x$ k1 T  f' Y( i1 c将CRISPRa和CRISPRi送入人多能干细胞也比较复杂。“使CRISPRa和CRISPRi进入70-80%的细胞依然很难，除非你使用病毒来递送。通常我们说的都是30-40%的细胞，”Cowen指出，他正在用CRISPRa激活和验证报告基因。这种方法对他很有帮助，因为iPSC很难分化成他想要的肾内皮细胞。5 v- C5 A: ^0 G9 d

+ I) N/ W* z9 t+ Z3 U8 V我们基因组的80%会转录成RNA，但这些转录本大多不生成蛋白质。近年来人们发现非编码RNA往往与人类疾病有关，不过绝大多数非编码RNA的功能还是未知的。CRISPRa和CRISPRi特别适合分析非编码RNA的具体功能。前不久，The Scientist杂志联合CRISPR的开发者和使用者共同编写了使用CRISPRa和CRISPRi的入门指南，帮助研究者们更好的研究和调节基因组的编码和非编码区域。
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在CRISPR系统的基础上使用sgRNA文库进行遗传筛选，是鉴定基因调控子的一种有效方法。研究者们可以通过CRISPR筛选在基因组非编码区域中寻找功能性元件。不过这样的应用需要高度覆盖又简单实用的自定义sgRNA文库。耶鲁大学医学院的研究人员开发了一个名为Molecular Chipper的新技术。该技术能够针对指定基因组区域生成密集覆盖的sgRNA文库。
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原文标题：Using CRISPR to Edit Genes in Induced Pluripotent Stem Cells

gscao

很好的资料，学习了，谢谢！