养脐带间充质干细胞等问题

gm3771052

我用的是 脐带组织贴壁法：处理 剔除 动静脉，然后剪碎，离心，培养瓶培养。) F7 b8 T8 c# Q. j! ~$ [6 C$ y) V( C( H
用的是无血清培养基（要求无血清的）   培养基是以前同事推荐的他们公司在用，他们培养的还行。
, g$ n5 T; a* u4 t6 _+ u  基本上第一次换液5到7天，在第二次换液基本上就有原代细胞出来了。* ]' I) q8 s$ S$ {( O3 \
最我在养脐带间充质干细胞遇到了一些问题：& E0 h7 i% }1 `) o
1 原代细胞里面有很多红细胞8 u! O/ w! g, R% P6 q" R+ X
我想知道红细胞有没有好的方法去除，是不是操作的原因导致的红细胞多。红细胞对间充质干细胞生长有没有影响。6 S* e, e  V' m5 n' v7 u6 H+ K
2原代细胞出现了老化的现象; K$ @& N( z: a( s7 w1 B0 o; C
原代细胞个体很大，形状很差，不规则
, c! ?  d( p/ _5 F3 p* O3传代后P1个体也很大，形态更差了 " |/ Q. s; O$ x. ]  Y5 j; k. n4 h- k/ z
考虑到可能是脐带个体差异，所以我又培养了一根。情况跟上面的差不多，所以很苦恼，希望有经验的朋友给点建议
; t1 j+ P4 z- }, e看看能从那些方面进行改进  ：流程？   还是培养基？     

五口二木

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- r. T9 P' R4 W3 q6 p* p  o
' s. W6 L% |) O$ ^, U- Y7 j4 c6 M5 `无血清培养基我没用过，不过刚用低糖DMEM培养基的时候也是出现同样现象，根本无法往下传代，后来换了培养基就顺利了

sunyandong

脐带要用盐水清洗干净，另外要去掉羊膜，只要华通氏胶

saliai2016

+ f- k  \4 c+ `  d

9 Q) S* G- `2 R6 b7 G8 ~4 V3 u0 h/ J我来回答你的问题：/ }9 N* T4 P+ ^; R

" M! V! A! v- G  q" B4 C7 }: Z! k1 原代细胞里面有很多红细胞
2 p  G4 f( F( e: E1 y2 b8 d我想知道红细胞有没有好的方法去除，是不是操作的原因导致的红细胞多。红细胞对间充质干细胞生长有没有影响。, k! y6 n( p8 V1 L8 l0 n
解答：红细胞是因为脐带静脉动脉中的血液，没有去除干净。在剥离脐带前，用2把镊子夹住脐带，来回刮脐带，挤出血液，连续用生理盐水清洗，脐带太长的话，剪短点，用镊子夹住刮脐带，排除动静脉中的血液即可，效果非常好。
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2原代细胞出现了老化的现象
: C  t0 O  y: R. {/ M原代细胞个体很大，形状很差，不规则: N2 @8 u, E: N
解答：原代老化，原因可能是：培养基有问题，一般DMEM/F12+10%FBS(Gibco)的培养方式是没有问题的。另外可以加一些生长因子如bFGF等。静止培养一周后，适当换液，观察是否有细胞贴壁生长。原因二：脐带分离，还需要去除表面一层膜，你没有去除干净，细胞也会很杂。
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3传代后P1个体也很大，形态更差了 ( e( W, S6 O& v( _8 m% k- W' u
考虑到可能是脐带个体差异，所以我又培养了一根。情况跟上面的差不多，所以很苦恼，希望有经验的朋友给点建议
7 M) I3 X# ?2 N" S6 O看看能从那些方面进行改进  ：流程？   还是培养基？    8 I4 C  a* i. E' `' E
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解答： 参见问题2，原代没有培养好，传代细胞只能更差。

gm3771052

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3 ~: `+ G; Y: t) A2 W8 F- F  ]1 t, k) L8 n2 ?9 o' l& |- _/ f
非常感谢！！！！！！！

晗晗

里面红细胞太太多可能是因为血液没有洗干净.用缓冲液多洗几次,一定要洗干净  H* S# {. w- q* D9 M
还有就是细胞老化,可能是因为你养的时间太长了,你要勤看看,5-7天换液是不是时间有点长啊,一般看看2-3天就换液看看,还有就是细胞你刚养的时候每天都看看,希望对你有点帮助

15122224893

我用无血清培养基和F12+10%FBS比较过，无血清的长得稍慢但是状态还是很稳定的

ljj0558

红细胞较多的话，谨记一定要清洗干净。分离华通氏胶时，就要尽量清楚血液。
) U! Q. o; B; D; i  m至于细胞形态变化，可能是原代细胞接种密度的关系。谨记传代时细胞密度在30%左右，细胞传代的密度也不要太高。

woshibotao_01

细胞已经成片状了可以废弃了

luyue6453

回复 gm3771052 的帖子) k+ ^1 H+ ?6 e9 M- e. m

6 w  S7 B) |  l: C" o红细胞太多主要是没洗干净，你可以把华通氏胶剪碎后放到试管中，反复用生理盐水冲洗，离心，冲洗离心，至于细胞过老化建议你换血清试试，培养液血清对细胞形态影响很大，最普通的DMEM都可以养起来的。