细胞培养常见问题分析，献给刚接触细胞培养的小伙伴

生物太次郎87

细胞培养常见问题分析
* y/ T( @) ^2 z7 _) [; z: S1、冷冻管应如何解冻？ % Y  W; N$ E+ L; X8 _
取出冷冻管后， 须立即放入37 ℃水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 - @) }9 A" ~% T" k! t- H5 w: j
2、细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？0 J4 m! N/ }; o, j, u8 S
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 / P+ x: B3 A& I( O1 A: B5 }
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？
5 }4 o) _2 A, r不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 , W7 J! {# c, |  Q
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？* Z; |! [8 ?+ y$ I3 M
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 : @. F0 l7 H- ?4 {3 G& w
5、何谓FBS, FCS, CS, HS ? , P6 d3 X3 @0 p* S3 R
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 3 {! ~" I% ^" w1 s- D
6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？
, T, _+ s* r% ]' H7 q; p) A+ J一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。 - N6 b4 R: T. v6 l# O- e$ k
7、何时须更换培养基？ ) t7 w" J  Y# F. h
视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 / J3 i9 j: t" V; ^' {
8、培养基中是否须添加抗生素？
) t: h9 S, X) h9 @1 x除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。
# R0 ?4 H9 e; o8 D, q9 b/ {- r1 |9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？ # y, ^0 P+ ^3 \9 k/ c
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于–20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。 ! L/ N& c! J/ A' `
10、悬浮性细胞应如何继代处理？
. I  L* Y2 F3 P! m0 L2 j" o一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。
2 V/ o8 t5 g) I11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？/ I1 P( ?: `8 d- S0 ~
欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。 4 P2 D$ v' r7 N! n' m" t( g
12、细胞之接种密度为何？ 7 w0 j9 C+ f: S5 `$ p& w
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 2 |, ~4 ]$ m2 P: S
13、细胞冷冻培养基之成份为何？
/ ?2 l! y; T- o( D" t8 _, n动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。 $ x9 a# S+ j0 D' ?- N* i& E* ~
14、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？ # Y5 r( j) C4 _
冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
8 Q7 c; W+ i( K* Y9 S15、冷冻保存细胞之方法？ 5 l/ r( Y5 [1 \. k' S! }- k
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。 0 e! {  U8 P* B, g# r( n+ }
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 1 L3 y( n/ _9 ~9 U
15、细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
# l: p. Z, o2 ]7 H& ^: c3 K冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
0 [6 x# y; i/ r7 I+ h- f16、应如何避免细胞污染？
. \8 X% w& ^+ V$ ^细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
3 I" a4 C" G% k1 X5 |  V17、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ " S; I; b; h1 e: x6 y
加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。
$ q% M! l+ L, d3 O18、支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？ 9 o5 {' {2 Q: A0 w( M, T$ z; ^
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
8 j! P( A4 G8 C: U( L3 S$ M1 ], j19、支原体污染会对细胞培养有何影响？
9 ~( D( u: t3 m9 v支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。, `- n; w/ Q, r' U3 X2 N* k
20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？
/ @" [" ?$ D" d5 L2 k5 c定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。   j8 S" k; q  M
21、为何培养基保存于4 ℃ 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？
4 ?9 i# D& M/ O1 t1 i" E/ f培养基保存于4 ℃ 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。
; G) Y3 o2 D( e* }22、各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？5 k% V: ]7 U3 V4 T, \
不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。 - b. F$ Y$ n) ?, Z
23、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？ 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ " E- q+ _5 D& s0 E/ u$ v" e9 v, q
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。 : d" i3 y# d1 p$ H* e" G
24、收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？: m; s! w& w0 Q, x6 F
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧 。- t- N9 b1 E: N3 e7 i7 t" {
25、如何选用特殊细胞系培养基？ 3 P- e% [, `3 o" q" l' [' |" t
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。 ; r2 X6 r5 X* M
26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ . C5 X4 w( z( ^( y  p  h4 s
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
/ Q- x% r8 o2 ]/ W27、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
0 a2 o; z3 k* {: m0 Y5 SGlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。
5 b1 t" v$ N' B( d& Q. u. Q28、什么培养基中可以省去加酚红？ ! I9 E6 f: z( V- ^5 V( b
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 5 ?/ B! l' e6 M; S. N7 C
29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？8 b8 t9 ?, m" Q. t
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
$ _& V8 V  m' d* k8 Z30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
- m) W: A9 \! s4 a2 V3 y+ B二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 - V( ~$ ~' s& z" Q
31、书上说，Hank‘s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle‘s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？
3 z, K* u+ w' A* Y' }HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。1 T' ?! A; m$ J/ m# u* H+ ?# B+ X* ~
血清
2 X$ [0 ]$ Z' b1 U+ g1、保存血清最好的方法?7 Z% a# V( e  D6 r8 S/ D2 k8 y
建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
6 u1 E+ f; \9 k, `6 Z% P2、如何解冻血清才不会使产品质量受损?
2 J, C& @& p% g" X5 l! X( `建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。' |, i: N; n% c0 `( t9 I: L
3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?* v6 T5 D- X. _0 W, j) I$ V% }, c4 x
血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。
2 ~5 q% t; g- F4、为什么要热灭活血清?
3 j1 s  a* r/ _6 h加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
1 c1 _( i! W& Q# q6 l5、有必要做热灭活吗?
3 p/ a# S- z  t( U% A4 Z/ X! _实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
$ V' ?: H" o% h5 Z) o+ g6、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?: l% k8 o+ M% Q+ \
GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。
2 w' ^4 t: x9 v9 H: @7、如何避免血清里沉淀物的产生?
9 \+ a4 ~6 Z5 p解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。) N& G" ~$ B3 R( _. g& r5 ?% h
解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
$ c0 s: x: q! h8 q血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。2 A( ]. x+ P' d. g

breakutopia

很好的资料，谢谢" q) A2 F  ~" ]' H9 }. E% X& n