关于复苏细胞贴壁的实验探讨

saliai2016

复苏细胞未贴壁的原因有哪些？
" \7 D) |4 Y+ L& V3 E5 Z& `2 E1、水浴解冻时间6 P& ?3 O7 m& J
2、冻存液未加DMSO: |0 j. n! h! O0 k# v
还能有哪些原因呢？

veda327

冻存液未加DMSO？这样也能叫冻存，细胞在解冻的时候早就裂解成渣渣了！
! ]% i5 s1 ?. h1 h' ~4 T; Q关于DMSO,; H% r8 m- v' O  W& a3 P0 E, ]
1.DMSO是细胞内防护液。DMSO能快速通过细胞膜进入细胞内部，在细胞冷冻过程中，维持细胞内外的水和离子平衡。将DMSO与右旋糖苷等细胞外防护液组合使用效果更佳。
0 R$ z/ p1 `4 ]7 O2.在常温下，DMSO是有细胞毒性的。因此在往细胞悬液中加DMSO时，要在冰水混合物中进行，一方面避免加入DMSO时放热，对细胞造成损伤；另一方面避免温度较高时，对细胞的毒性。  I+ |2 o, _" ]9 B- [' f5 k' _, O
3.细胞冷冻时，DMSO的浓度一般控制在5～15%,不能再高，否则也对细胞有毒性。一般用冷冻管冻细胞时，体积一般再1～1.5ml，当把这些溶液加到20ml的培养液中时，此时DMSO的浓度只有0.25～1％，浓度已经很低，对细胞的毒性不大，培养转替换液最佳。 . o! l% [9 d$ j- u' Y' {5 V
: m. U, g0 f, N2 I9 p
水浴解冻：温度在37-40之间，解冻越快愈好，越快解冻，细胞内越不容易形成冰晶。
% @% @% `( H$ s( P9 _+ z- K
% P- u7 I2 j  K$ ]; j7 U还有的问题：
6 X! ?& A( b$ |+ c+ R5 x! j" C1. 冻存时的程序降温& I$ |& o9 a, @  u- A! ~4 F8 I
2. 细胞是否受污染，包括操作和试剂
- D! K9 H) |/ p1 I3. 细胞数量，太少细胞分泌的生长因子太少，细胞长不起来% [+ L# I8 q; p
4. 保存温度；如果是冻存在-80度，时间不超过一个月；相比液氮冻存，细胞复苏存活率也低一些

fenlichong

很可能是冻存前贴壁细胞状态不佳或消化过度造成的。如果是细胞系的话，密度即使低些也能慢慢长起来。冻存液的配方网上有很多，可根据实际情况配制或买公司的成品。水浴锅自然是要提前预热到37℃，细胞从-80℃冰箱或液氮罐中取出后快速摇动溶解，转移至装有培养基的离心管中离心洗涤。还有种可能是细胞储存的低温冰箱或液氮罐经常打开，细胞活性也会受到影响。

yingfeixiang

回复 veda327 的帖子# e* b! m) l3 A+ [
. ?4 p% {+ G% M
基本都是楼上说的了，太全了

yeshch

既然楼主问的是没有贴壁，那么是不是用的培养皿/板是低贴附的用于悬浮培养的？或者您是feeder free还是有MEF的，跟铺板也有关系？

whywho

1、冻存前冻存液要进行预冷5 k# i& u2 R3 q
2、冻存复苏要遵从慢冻快融的原则' c, K/ N: s9 B& _' ^1 ?2 |
3、条件允许的话建议冻存时使用程序降温盒（里面添加异丙醇），可直接将冻存管放入程序降温盒后放进-80冰箱,24小时后转液氮! C/ G# T7 l, u2 W4 z/ D7 J, X
4、复苏细胞要快速溶解，但不要剧烈振荡细胞。

wind789

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8 x: p. E6 O1 d0 p; Y  i6 P
3 F0 |) _* F, o6 H另外可考虑，1、培养基的原因。
2 x" f1 x  b% r; y8 Z% F2、污染。5 ~. T- F1 V9 W& M7 p( P
3、冻存过程中有温度变化。
3 k# Z5 T  R6 ^4 I* y  E- d4、培养皿有没有拿错为非TC处理的？