内皮祖细胞的分离

Diane0321

实验要用到内皮祖细胞，但是我刚进实验室，并没有什么经验，在做之前，想请教一下有经验的大神们，有没有比较完整的分离和培养步骤以及注意事项什么的，非常感谢~~

coffee.cat105

内皮祖啊，你要先搞清楚自己想要的到底是会生长会成血管的那种呢，还是不长的那种，不然很容易坑…………

Diane0321

哦哦，我是要会生成血管的，刚进实验室不久，很多东西都不懂呢，你有什么建议吗？

coffee.cat105

* V6 S4 L) M. p  m7 ~
/ G$ X4 Q& s4 a% z) |( A
5 \8 e8 c' b$ F; i; V4 }这个简单啊，我们做就下面几步4 G9 s" \% v2 b! }( b. ~) d
1] Fibronectin铺6孔板，过夜
1 ~  N% q2 V3 g' H* S4 Q2] 新鲜血20ml，ficoll分离脐血单个核细胞，200gX5min，洗涤细胞1次，EGM-2培养基重悬。
9 {$ V3 O/ s) z; q) B8 @: D7 F3] 1X107/cm2密度将细胞接种到铺好Fibronectin的6孔板中，37℃、5%CO2条件下培养。4 C3 P$ V1 ^# i% U
细胞培养24h后换液，之后3d换液一次。& f! \: [' ~' `" H5 Y, I3 f) `
4] 7-10天形成铺路石样克隆，基本每孔都有1-2个，差不多就正常传代就可以了。
0 G  n+ b) c+ x/ a: I# ?0 e5]1传3的密度传，大概也就３天长满的样子
: ^8 m* T) C& C" |# q- R+ b: ]( z没了，很容易的  d4 I% a$ L- g% m% W
不要用瓶，瓶容易坑
3 L. J2 y0 e/ A6 ~不要用羟乙基淀粉分离单个核，容易不贴壁
9 b# e1 B. B: v: g7 N: k培养基用lonza的EGM-2就可以，EGM-2mv也行，只要看你下面的实验，在长出来这一步没有区别- b  l( [  g9 J  `) E% j
4代之内成血管都不会有太大问题，4代以后成的血管就可能会不太好看

Diane0321

嗯嗯   非常感谢您的帮助  

meredith603

单个核细胞种入皿里（每孔4ml培养基）后第一次换液时间推荐是4天后，而且这4天里不要摇动皿不用观察。这样每个六孔板的孔中多则可以达到20多个克隆，少则也有三五个克隆。传代的时候还是计数一下细胞，每孔（六孔板）5*10^4细胞比较容易长起来，但是其实每孔1000个细胞也能长起来，扩增倍数可以达到400-500倍，也可以形成二次克隆。

meredith603

另外，血液千万要用肝素而不是其他抗凝剂抗凝。羟乙基淀粉基本长不出克隆。