求助，关于Ki67免疫荧光染色的问题

听不到

  对pc3细胞做Ki67免疫荧光染色，但是怎么染，Ki67都是胞浆着色。我查了下，Ki67是核蛋白，应该就是核显色才对啊。我上网查了下，好多人也是出现这样的问题，然而并没找到解决方法。我的整个流程是这样：
$ p  X0 B% {) l6 Q; B细胞多聚甲醛固定0.5h，0.5%triton打孔0.5h，pbs洗，BSA封闭1h，Ki67在4度孵育过夜，pbs洗，二抗室温避光孵育1h，pbs洗，DAPI室温孵育0.5h，pbs洗，甘油封片，荧光显微镜观察。我对于免疫荧光已经做过很多次了，自认为没有什么手法问题。希望有大神可以帮解决下。
6 U) V9 Q6 q- M5 Y1 P下面是我做的片子：
$ B7 f9 C! o* S* C( T( T6 `+ {

2016-3-9 22:19 上传

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ki67

2016-3-9 22:19 上传

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dapi

听不到

忘说了，红色荧光是ki67，蓝色是dapi

顺其自然

可以看出第一张Ki67的荧光图片背景很脏，所以，我猜测是否因为一抗的浓度过高引起的啊，因为可以看到除了胞浆强荧光外，胞核其实也有部分荧光信号的，估计那就是你要检测的Ki67,但由于一抗浓度过高，导致胞浆着色很强。
- R( ^  P2 C' {; y) q个人观点，仅供参考，欢迎讨论！

听不到

回复 顺其自然 的帖子) L( g6 d" @3 d0 D# ^) f

( y4 V2 n2 _( W感谢，总算有人回复了，我一抗按1:200稀释的，不过是按说明书来稀释的，但是我想的是如果一抗再稀释些的话，那会不会只染了胞浆呢，不过我还是试试吧也，谢谢啦~

cneagle66

同求

biovictor

回复 听不到 的帖子. s3 R3 k2 L; Z6 g5 r% p
8 u; ~3 i' Y! B9 g/ i
请问楼主是石蜡切片还是冰冻切片？如果是石蜡切片的话，楼主就要注意抗原修复的方法了，如果用的柠檬酸盐水煮法，可以换成EDTA处理，或者蛋白酶消化处理。仅供参考。

听不到

回复 biovictor 的帖子5 F) m/ {! n; P  ]8 n% L
  [. |! R, \& D* w  m4 l
我是直接细胞长好后用多聚甲醛固定的，理论上不用抗原修复

biovictor

回复 听不到 的帖子
7 ~3 H" g. D7 q" L
: V! {7 a) ?3 x$ k' m哦，我还以为是切片呢！那就不是抗原的问题，在下认为可能有两个问题：1，有可能是抗体的问题，不知都楼主有木有看看抗体公司的描述？2，Ki67主要在核里，但是在胞质里多多少少有一点儿，因此，比较大的可能是核膜没有打穿，楼主有木有换一种透化液，0.5%TritonX-100浓度有点儿低啊！

听不到

回复 biovictor 的帖子
! a9 x# C+ Z- }, _& Z! ]5 T, Y/ t& R8 b# V# s/ d
0.5%低吗？我看大家用的都是0.1,0.2%的呀。至于这个核膜没打开的事我问了我老师，他说既然细胞膜被打孔了，理论上核膜就也被打孔了，而且貌似核膜本身就是有孔的吧？我现在怀疑是一抗不好使，打算换个一抗

biovictor

回复 听不到 的帖子* D& n) T* F6 Q# z" G
3 I4 w! P$ e+ Z6 G% J% w
嗯嗯，一抗不好使，这是最最最令人无奈的了，加油楼主！