细胞倍增曲线的制作方法及原理

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" _/ c: t' \" j+ ?细胞倍增曲线的制作方法及原理  （细胞在传代至哪个阶段开始做？怎么做？几种方法？那种比较简单？求助）

Tracy-Cui

1 细胞计数法：A）取生长状态良好的细胞，悬浮的细胞直接计数传代；贴壁的细胞采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液，计数传代；。记录下接种细胞的量。如果是贴壁培养的细胞建议多接种接种孔板。 B) 计数。每隔12h或一天（根据具体的细胞种类）进行计数。培养3～5d（根据具体细胞）要给未计数的细胞换液。  C） 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。6 h; j* ^- f1 w# j5 f& K. s
2.MTT法：A) 接种细胞，培养细胞。细胞接种于孔板中。注意接种于孔板中细胞的量要一致。 B) 呈色：每孔加入MTT溶液，37℃孵箱中继续孵育，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（1000rpm，5min），然后弃去孔内培养液。每孔加入DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。C）比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。

king8

细胞增殖的研究方法有： MTT，CCK8，BrdU，EdU，等方法。
% C+ d8 A- c2 v/ ]5 c3 YMTT检测
# n1 r/ x! ~8 b+ D. K# eMTT检测以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT是一种黄颜色的染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，从而可以对细胞的活力、增殖与凋亡情况进行检测。8 R, g4 ]7 B8 l  @
CCK8检测
! @8 C% S* `* P9 l. y; mCCK-8的原理跟MTT是相同的，不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差，其重复性优于MTT；且对细胞毒性小。; O5 D* n7 @2 Y" P7 o1 a" L2 Q! t
Am-Blue方法检测* i! l) u) ]# P
Am-Blue检测试剂的主要成分是一种氧化还原指示剂。其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，处于还原环境。在还原状态下，Am-blue转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，其吸收峰为530-560nm，而散射峰为590nm。最后用荧光酶标仪进行检测，吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。Am-blue为水溶性试剂，无需固定、裂解细胞，只需一步操作即可测定，使高通量筛选更高效。不影响细胞代谢、细胞因子的分泌和抗体的产生，细胞仍可进行后续实验。' E2 M" k+ t( Z3 V; a
1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。0 m- C2 L6 E  Q7 {# D
2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。
$ e% n8 ]( `, ]+ N  B4 J& L3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养3～5 d 常要给未计数的细胞换液。
# ]6 Z* I, W; U. B' t2 Q. |  d3 x4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。
4 {# u) Y  P/ t4 n5 h( y1 Y) k' `细胞生长曲线：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。
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需要注意如下：: u9 j  E4 \* @( m5 v1 A
1. 细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。7 J2 c0 M; e6 C* a7 {
2. 现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。# v7 o( e1 P4 D1 c7 p6 b0 U
3. 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。
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