诱导过程中挑选克隆的标准 与 iPSCs 的传代（有饲养层与无饲养层）

Andyhigh

最近在做重编程的相关工作，有几个问题一直困扰着我，想请教下！4 Y, X! w$ q% O/ ~5 q
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1. 自己在试验当中，发现克隆的同步性不是很好，大家是如何确定最佳时间的？刚开始自己是发现有一些克隆就挑选，剩下的继续放入培养箱继续培养，这样的结果往往是克隆摊开（应该是分化），甚至个别孔出现污染（细胞漂浮）；
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2. 大家是根据什么标准样挑选克隆的？先分享下自己的经验（第一，克隆致密；第二，克隆边缘清晰；第三，克隆未老化；第四，克隆呈现圆形 椭圆形等形状；重要性按照排名先后）额；即使是这样，发现自己的AP阳性率（AP阳性克隆数/克隆数）也不高（10%-20%），且能支持单细胞传代的就更少了，比例差距比较大，有些是挑选几个就出现1个阳性的，有些是挑选30几个才出现一个；效率太低；6 l% ?% Q& a# B( u, F4 ~+ d

  o6 `6 L' @/ o( N3. iPSCs 传代的问题，不知道大家用的是什么样的方法，是单细胞传代还是克隆传代？希望大家能回复下具体而详细的步骤！先提下自己的疑问：有多大比例的iPSCs 能支持单细胞传代，自己只了解06年 07年的iPSCs，单细胞传代能力还是一个不错的指标；4 i# b, p4 f" E/ ^9 i$ T

" P0 l' N: u  z5 K7 u. S! n4. 在病毒诱导出现克隆后，大家一般是怎么处理的？是手动的挑取克隆，还是用化学的方法进行消化传代····
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5. 无饲养层诱导和培养的iPSCs，大家是怎么进行传代的；最近，获得了一孔这样的iPSCs，本来打算扩大培养的，自己就用Tryple 消化的方法收集细胞，并吹打（30下）成单细胞悬液，以便均一的进行扩大培养，不过遗憾的是，细胞就这样无法形成单克隆了；自己推测的问题是，这样的iPSCs 无单细胞传代能力；自己查到了一篇文献，文献上说的比较模糊，只是说手动的挑选克隆进行传代！不知道大家用的是什么方法···% B+ T: f  r& p0 x0 h) g
, @$ M$ z% ?, R2 L7 ]
补充内容 (2014-12-15 21:46):
% X9 `2 F  Q3 _1 U9 i( ], u( l我的QQ：945366086
4 I; d+ i9 I: y( w, a, [3 Y
4 l1 W( n/ m: @% k  ]- j补充内容 (2014-12-22 13:42):
1 r; l, |- I! `- o7 A不知道大家怎么消化克隆样的细胞的（主要指那些致密的克隆），自己发现按常规的方法：1个克隆加入300ul tryple 轻轻吹打20-30下，感觉消化不下来（消化下来的细胞很少），也不知道是什么原因，基本排除试剂的原因

Andyhigh

回复 zhangweihwz 的帖子2 x/ I1 y/ ?) T. U

% n# P- i( A) i+ d+ p能帮助解答下其他几个问题嘛，发表点看法也可以哈！

Andyhigh

回复 葱葱 的帖子
. u% e$ o: ~# g2 v' b) X& ~& `% D" |  }- E. c, L
今天才看到回复，你们可以直接回复我的帖子!  P, Z& a! M: m, _* k/ O' W4 o. R

7 _. j0 e0 e9 d0 c' N3 D3 q你说的用无饲养层 是指全程无饲养层嘛（包括无饲养层诱导和培养iPSCs）

Andyhigh

回复 陈阳阳 的帖子
+ i7 c" J) _+ S5 J, b- h9 A
: ^% @0 u1 d3 I6 i2 V0 X9 C欢迎多交流！

Andyhigh

回复 jojo1988509 的帖子
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/ q0 ]  e( b3 W- B也就多挑一些质量好的克隆了，能具体说下活染嘛？

Andyhigh

回复 mecol 的帖子
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细胞经 固定 透膜后都死了，所以是不照的！

Andyhigh

回复 jojo1988509 的帖子; ?2 @; h. F9 w2 y, E, a
  J  a# L: ~6 S, }8 l
可有相应的货号哈？