Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：4 Z! |# O2 E% D. o7 V, i$ I
      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，! e2 `1 T' l" e% N
       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
8 O9 ^3 B. y2 w" n1 p0 b/ k! I, j) a$ O) r& r& |
2、反应参数的确定：
; o: [( C* h/ V) F" Z& L  i* c       一般为：94 ℃，10-20S
% f  A- G" q; X3 T' h7 V# M                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
* D( U( e5 O4 W                     
. @: b7 X: b6 s% Y5 n# p3 V3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值: ]: k8 T1 N& h' v/ I/ \( d, e
       引物浓度：50-900nM
8 Z% s& n& K$ n% K       探针浓度：50-250nM4 K( W7 \, t, C