Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：6 d  B( V8 z0 g+ `
      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
6 c$ H9 z. }& V/ e5 v6 ]! ~       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
' h$ O3 z% @( P; D/ |& @0 [+ b0 w& J, h5 [' j& {0 N2 B
2、反应参数的确定：
) e. Q/ r% \: `+ B: E* w       一般为：94 ℃，10-20S* S# @6 G, @, C0 l. o' d+ D# B8 J) E
                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度! d* c3 i+ B# ?5 V
                     6 n; R" C% H- A' z7 L7 Z
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值5 g2 ?2 Y- I9 z
       引物浓度：50-900nM
+ E0 A; G& J3 J' ?       探针浓度：50-250nM5 h9 E2 G) ]4 |

Tlexander

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) `4 B) {( g9 B( Q( z* f. u1 D
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