Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：
4 K* Z0 |5 W! p/ u$ y. x      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，0 \* f6 F$ g( ?
       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ 8 F- D8 x( j$ P6 X3 u: x
( v. b9 {4 u3 S- o9 [0 o5 o
2、反应参数的确定：8 a" e! c1 ]) {' N) d: c" e% H. G
       一般为：94 ℃，10-20S
# ^( J2 J7 u, K) j                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度1 j  w" b* E, e2 h, b
                     $ r1 X' ^- l, U8 g- T
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
2 U/ P9 @) ?$ j6 [1 c0 ~       引物浓度：50-900nM& e* T5 |0 Q" a+ B- z
       探针浓度：50-250nM- k* P0 d2 l  V2 o3 F5 T

Tlexander

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