克隆基因中包含有内含子，表达时会被正确剪切掉吗？

刘森泉

真核表达载体克隆基因的时候把内含子也克隆进去了，在转到细胞里面表达时，这段内含子会被正确剪切掉吗？谢谢！

cyberpig

視乎基因而定. 如果基因來相同／相似物種，内含子很大機會可以被正确剪切掉 （另外當然要保留5' splicing site, 3' splicing site and branchpoint adenosine）。如果基因是來自不同物種，用cDNA則比較安全。不過，我相信一般實驗室都會直接用cDNA。

刘森泉

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, Y, B- T5 ?4 v- `) h首先非常感谢你的建议。我主要是pcr-cDNA扩不出来，拿了很多sample试了都不行，这个基因只在发育过程中一段时间表达。请问哪里可以查到某个基因在什么细胞株或者人体什么细胞类型中表达？谢谢！

cyberpig

刘森泉 发表于 2013-5-22 20:50
4 Q% G' D) c' I回复 cyberpig 的帖子3 n9 ]' C5 m& @/ {- j
" D4 M9 l) G! q# u# S  `& @& |' N
首先非常感谢你的建议。我主要是pcr-cDNA扩不出来，拿了很多sample试了都不行，这个 ...

8 L+ [# e5 P/ U) f0 u* [我想可能要查一下關於那基因的review／文獻（例如那基因是否在其他相似的model organism中也表達）。如果那是比較新／很少研究的基因，我想可能需要解剖不同發育程度的胚胎，再做RT﹣PCR，看看能不能擴出來。
0 w2 s: r; c  F. c* z5 X' ^% n' N
6 l, g* o# J  k7 |$ z+ H) m5 A另外我還有一個大膽的想法（不過不知道能不能成功），就是把（現有的）全段基因的dna放進有pCMV的質粒（令該基因在動物細胞不斷表達），轉染細胞，然後再做RT-PCR（理論上即使有內含子，在相同類型的細胞中也會一樣的切掉），最後直接用這個cDNA來做往後的實驗。不過風險就是不知道你這基因究竟是alternative splicing還是普通的splicing....

刘森泉

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非常感谢，讲得非常详细，我决定试下你的大胆的想法。谢谢！