胶回收的问题（续）

wwy551

上个帖子没法在回复中贴图片，所以新发了个帖子。还请版主见谅。' `: w1 M+ E6 r- ?$ U( Q* ]
如图，左边五条带是摸不同退火温度扩出来的，后面的一条是切胶回收后的电泳结果，应该不是降解，也应该不是PCR产物没跑开切到杂带，毕竟两条带差挺远的，而且我切胶切得很薄，五条带一共切了0.1g。

xray19

其实下面那条带是你回收DNA片段的单链，原因我就不解释了。你只需要注意2点，1是下面那条带的大小应该是上面条带分子量的一半。2是你把回收的DNA变性后缓慢复性后电泳就会发现只有一条带了。祝好运！

jlucute

回收的效率好低啊

gondobar

不是降解，降解没有这么单一的条带。建议重复一次，换新的电泳液，EB和buffer。不能解决可能要换PCR条件。

LuXK

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不是两次洗脱，就是同一次洗脱下来的DNA跑两次胶，产生了两次不同的结果。我现在大概知道什么原因了，可能是在回收的过程中DNA变成单链了，导致疑似杂带出现，但是在保存的过程中单链会自然复性，所以又变回一条带。这种情况我们遇到好多次，但是继续下游实验都没有收到影响。

huangcong1988

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) ~3 m( R+ E" w7 g9 E8 h9 n
其实你这个回收产物直接做连接应该也没有问题，连接以后挑菌再做克隆检测应该也没问题

huangcong1988

回复 wwy551 的帖子7 y( S/ ~7 _# E) ?) v  X

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huangcong1988

回复 wwy551 的帖子
$ k- H( C" e' \+ f) K
0 g. h2 ?5 w  v1 g' Y3 A9 H建议用回收产物再扩一下你的目的基因，这样的话，扩出来应该比你回收前条带会亮一点，你这个杂带的话，不会影响你的扩增结果的。

wwy551

回复 LuXK 的帖子- X8 `* y, W- [) [4 N$ j+ n

/ A& y( n* Q2 B3 w8 H5 U7 k3 y; a不知道你两次用的洗脱液是不是相同。我以前出现这种问题很可能是因为我洗脱柱子上的DNA的时候用了DEPC处理过的水，这个是酸性的。洗脱下来的DNA跑胶，很可能因为DNA本身和电泳液之间PH值相差很多，跑出来看似不正常的大小。

LuXK

不知道楼主的问题解决了没有，我现在也遇到这样的问题：PCR产物一条带，切胶回收后就出现了两条带，跟你那个很像。但是非常奇怪的是，连续跑了两次电泳检测胶回收产物，第二次就又正常了，下面那条带又消失了。不知道是什么原因，会不会是二级结构之类的？