关于mEB的悬浮诱导的几个问题

ligangtiancai

本人近期在做小鼠iPS的体外心肌细胞诱导，分别采用的悬滴和悬浮法，现有几个问题望大家解答：5 P( h( ?/ y% g1 o% x' B% z* ^' S# i$ p
( A2 T% s( |/ y4 _
1.直接悬浮培养EB是iPS细胞悬液的细胞密度是多少？3 E) V" v' `& _! |2 f$ H
2.悬浮后多长时间换液，期间是否需要使用摇床防止EB沉降和贴壁？( l' b4 g! S% p) u) y
3.悬浮后多少天可以贴壁继续培养？9 d8 S) [1 t' P) h4 G: ^9 O8 T$ ~8 q
4.对于后面的心肌诱导而言，悬浮法和悬滴法得到的EB差别有多大？8 k' Q2 P% V& t, @
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    谢谢！

wawj

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我也是做这个的。希望你有好的结果，大家可以分享经验。
7 g; Y' B) |/ b6 a1.悬浮的话，细胞密度要到3*10^5.
6 e) h% z9 A- A$ Y2.两三天换一次液，用摇床怎么用，放到孵箱里，太麻烦了吧。用那种国产的细菌培养皿，贴壁效果较差，就还可以。/ u& _% s- m& p& ]. g8 P) ~
3.一般悬浮5天后贴壁诱导分化。5 n0 X) i$ t% C& p+ g4 M3 a
4.应该不大吧。只要形成好的ＥＢ，对后面的实验差别不大。

ligangtiancai

回复 wawj 的帖子9 C" A$ W7 K7 E

( Z7 _" U2 K7 L很感谢你的解答，今天是悬浮后D1，看了一下，EB已经形成 ，但感觉漂浮的细胞较多，且EB都是挤在一起的，EB边缘不圆滑，有死细胞，不知这是否是正常现象？我用的密度是1.2*10^5/ml，如果需要换液的话应该怎么换？半量换液还是重悬EB沉淀后换液？谢谢！

frankieisme

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收集细胞和培养液到离心管,操作台中静止30民,EBs自然沉降下来,去上清,再加新鲜培养液继续培养.

ligangtiancai

回复 frankieisme 的帖子$ Z! l' R/ ?3 v, F9 s

4 G' T3 p+ t+ z& C5 U0 ~! Z. a" ~感谢，请问收集EB时应用什么器械收集，玻璃滴管或者1ml枪头？再就是收集到离心管中后是否需要轻轻吹打重悬，还是收集后直接等自然沉降30s？

刘森泉

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问下你怎么将小鼠IPS转至地粘附培养皿的，我用胶原蛋白消化后，移液管刮下来放在地粘附六孔板，但团块都很小了。

ligangtiancai

回复 刘森泉 的帖子. n) ^, c5 o/ ^5 |( S( R7 B
( a: U- k% f. x- X
我是用0.25%胰酶消化重悬 再差速贴壁45min后吸出单iPS细胞悬液，按上面的密度直接加入到超低吸附版就行了。培养基是是20%FBS-高糖DMEM+NEAA+L-Glu

刘森泉

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谢谢！消化后是用移液管刮的还是吹的呢？还是消化至整个克隆脱离？

ligangtiancai

用玻璃滴管吹打就行，可消化3分钟后吹打30~50下 然后加培养基终止后再吹打至单细胞

frankieisme

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移液管or1ml枪头都可以.