关于mEB的悬浮诱导的几个问题

ligangtiancai

本人近期在做小鼠iPS的体外心肌细胞诱导，分别采用的悬滴和悬浮法，现有几个问题望大家解答：
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% h) g/ s: I& y4 e/ u1.直接悬浮培养EB是iPS细胞悬液的细胞密度是多少？3 J* b$ l5 B+ ~0 N' g3 h- J
2.悬浮后多长时间换液，期间是否需要使用摇床防止EB沉降和贴壁？- ~: Z7 p. G9 B
3.悬浮后多少天可以贴壁继续培养？# |/ n/ k& B9 t
4.对于后面的心肌诱导而言，悬浮法和悬滴法得到的EB差别有多大？
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    谢谢！

wawj

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$ W" `$ H! B# P  d* D/ O: U我也是做这个的。希望你有好的结果，大家可以分享经验。
& e+ X" h. u% w1.悬浮的话，细胞密度要到3*10^5.* ]3 _/ X, f- ^# x$ v5 o
2.两三天换一次液，用摇床怎么用，放到孵箱里，太麻烦了吧。用那种国产的细菌培养皿，贴壁效果较差，就还可以。
4 m+ h, P' S: P. H9 m3.一般悬浮5天后贴壁诱导分化。
! q+ S$ V6 A9 u. I! h4.应该不大吧。只要形成好的ＥＢ，对后面的实验差别不大。

ligangtiancai

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很感谢你的解答，今天是悬浮后D1，看了一下，EB已经形成 ，但感觉漂浮的细胞较多，且EB都是挤在一起的，EB边缘不圆滑，有死细胞，不知这是否是正常现象？我用的密度是1.2*10^5/ml，如果需要换液的话应该怎么换？半量换液还是重悬EB沉淀后换液？谢谢！

frankieisme

回复 ligangtiancai 的帖子# H. K3 f8 W5 k; S& X7 C7 t+ ?

4 F( j! {' Y3 G! l0 D( o1 [5 T收集细胞和培养液到离心管,操作台中静止30民,EBs自然沉降下来,去上清,再加新鲜培养液继续培养.

ligangtiancai

回复 frankieisme 的帖子9 _- S" f$ I( E& _2 x/ {- [
8 n0 [8 j% V& \) k
感谢，请问收集EB时应用什么器械收集，玻璃滴管或者1ml枪头？再就是收集到离心管中后是否需要轻轻吹打重悬，还是收集后直接等自然沉降30s？

刘森泉

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% G" m1 {' K5 E- a: A9 ^问下你怎么将小鼠IPS转至地粘附培养皿的，我用胶原蛋白消化后，移液管刮下来放在地粘附六孔板，但团块都很小了。

ligangtiancai

回复 刘森泉 的帖子8 \0 f+ G  z; w$ W

8 n: d& |# s9 e% }% U我是用0.25%胰酶消化重悬 再差速贴壁45min后吸出单iPS细胞悬液，按上面的密度直接加入到超低吸附版就行了。培养基是是20%FBS-高糖DMEM+NEAA+L-Glu

刘森泉

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谢谢！消化后是用移液管刮的还是吹的呢？还是消化至整个克隆脱离？

ligangtiancai

用玻璃滴管吹打就行，可消化3分钟后吹打30~50下 然后加培养基终止后再吹打至单细胞

frankieisme

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0 }* u; ?; I& n& X& q& ?/ y移液管or1ml枪头都可以.