Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题

runsong

我们做western使用的裂解液主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，冰上将细胞吹散并裂解30分钟，之后12000转离心并弃上清，-20度保存。但此蛋白样品在保存过程中会有絮状物生成，严重影响蛋白浓度测定与使用。不知大家有没有遇到过此类情况，是何原因，如何解决？

YYQ6301

我们两种处理方法，一个是离心去沉淀，一个是煮好后保存

biotly

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% _' F- m3 i% i: W; H4 I! i
- \# O  r0 u1 [+ e9 ]这样子可以做出来吗？条带好不好看啊~~很期待

cjian6352

可以在保存前测浓度，然后加loading buffer煮了再保存，这样蛋白更稳定，不易降解，对后续实验也方便

sykbod

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, S# V$ U. Y1 g& j
$ u( `; R) k* y; U1.       5 ug/ uL. Higher conc. leads to deposits.
/ J4 O. ~$ A( X* J# r1 Z2.       Genome DNA looks like white flocculent deposits. But not your case I think.
$ `2 |! f7 y0 f. p  D3.       Depend on which pr you want to harvest. Membrane pr? ribonucleoprotein? ...
6 ~$ `0 }! ?% n1 V$ ?) d- T          generally, your lysis buffer should be good.
: ]# |' i7 e1 V9 M" g' |+ K

zxcv12345

回复 runsong 的帖子: p, w1 C* j: ?  Y5 o5 G

5 O2 X. I! T  ]: n' ]' ]5 d0 o1.一般浓度一般低于5ug/ul，最多不会超过10ug/ul+ b9 H- z. J" V# S) [
2。对不起，与DNA关系不清楚，但离心后大部分的DNA都沉下了，应影响不大
7 o: N8 a; e  T" O+ v3.裂解液的问题应该不大

zzzhouzhong

我们实验室比较懒，做western直接PBS重悬细胞后加4*sds loading buffer煮，然后离心上样。做IP啥的才裂解，给你我们的配方。。NP40裂解液: 1M Tris8.0储液10ml，2M NaCl 15ml，NP40   2ml，dd水 173ml，配好后取50ml，加1片蛋白酶抑制剂PNSF，溶解后分装1200ul每管，-20保存。另外我们蛋白样品一般放-80，不过貌似跟这没有关系

runsong

回复 zxcv12345 的帖子% m0 R/ U- P3 U% {& b. J

5 C, i" n0 f# _5 h5 M6 d1 p+ d7 O谢谢。还有几个问题。9 K* z( [9 h. x( l
1、你们用的浓度大概多高啊，我一般是大约20微克每微升？! U  X7 J1 r7 G' n3 e
2、形成沉淀与残留的DNA有无关系？
3 k, n2 k' M' o! n& v3、我所用的裂解液有改进的必要吗？
: v( L3 T1 p# K. \( s

zxcv12345

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5 f7 k; L9 _& M" M' w/ G& ~( C- n; L
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。
0 L! _$ R3 i7 h0 ]
+ @" a% F# R/ b2 n! u) T2 ^) U) U3 x/ i在冻存前，可降低浓度。7 O) @+ m! w/ `
如果不容易降解，可考虑4度保存

zxcv12345

回复 runsong 的帖子( ^! z3 l$ f- c5 Z: w
4 ~# t1 I; n# c
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。* n, ?' K: u2 g" [/ O' ]
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在冻存前，可降低浓度。1 L9 a3 T. J: X2 r3 K; K$ h% E
如果不容易降解，可考虑4度保存