Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题

runsong

我们做western使用的裂解液主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，冰上将细胞吹散并裂解30分钟，之后12000转离心并弃上清，-20度保存。但此蛋白样品在保存过程中会有絮状物生成，严重影响蛋白浓度测定与使用。不知大家有没有遇到过此类情况，是何原因，如何解决？

zxcv12345

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; e3 W! b4 w' ]8 h7 J  _2 {7 d) L0 @5 ~4 i
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。
7 {: J7 X1 F  P# \* p6 i- s2 F& _/ S
在冻存前，可降低浓度。0 P1 \& I' D5 l* l3 H
如果不容易降解，可考虑4度保存

zxcv12345

回复 runsong 的帖子- L& Q/ G9 m, B$ M! x9 u
9 `% A: t& @! J9 Y
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。; N  }7 I9 R# ^" @

2 \; j+ G! u( t0 h; a9 e' w在冻存前，可降低浓度。
$ D0 N2 O6 b6 ~+ s如果不容易降解，可考虑4度保存

runsong

回复 zxcv12345 的帖子) u: H* w; z( U+ V
6 h' Z, u7 p& p- f
谢谢。还有几个问题。! t5 u: b. @" w" u5 w
1、你们用的浓度大概多高啊，我一般是大约20微克每微升？
0 q* q/ _  ~( {/ S) Z% C2、形成沉淀与残留的DNA有无关系？* a" Z% k6 m: y5 O  E  t
3、我所用的裂解液有改进的必要吗？
- t8 a# F( _9 R

zzzhouzhong

我们实验室比较懒，做western直接PBS重悬细胞后加4*sds loading buffer煮，然后离心上样。做IP啥的才裂解，给你我们的配方。。NP40裂解液: 1M Tris8.0储液10ml，2M NaCl 15ml，NP40   2ml，dd水 173ml，配好后取50ml，加1片蛋白酶抑制剂PNSF，溶解后分装1200ul每管，-20保存。另外我们蛋白样品一般放-80，不过貌似跟这没有关系

zxcv12345

回复 runsong 的帖子6 e- Z8 b% i+ x* Z1 a1 x) T  f/ e- J) E" o

! R4 n+ I* K, p1 P+ F# `0 N1.一般浓度一般低于5ug/ul，最多不会超过10ug/ul
, A. d, G% G6 r) A8 R, A& p2。对不起，与DNA关系不清楚，但离心后大部分的DNA都沉下了，应影响不大
9 M' i  d/ k# y& q5 ~0 Y7 t! q0 Z3.裂解液的问题应该不大

sykbod

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# Y, Y3 P8 `* G' E9 l7 h  w1 r* X) b) U% j5 }
1.       5 ug/ uL. Higher conc. leads to deposits.
% E+ k, g/ }; i  K, U! Q, U) x8 F2.       Genome DNA looks like white flocculent deposits. But not your case I think.( P' A/ ]  n; G, a
3.       Depend on which pr you want to harvest. Membrane pr? ribonucleoprotein? ...
9 v: b  ~* b' L3 ~4 r! C& H! f( |          generally, your lysis buffer should be good.$ p+ s3 ?8 S4 R

cjian6352

可以在保存前测浓度，然后加loading buffer煮了再保存，这样蛋白更稳定，不易降解，对后续实验也方便

biotly

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+ P( S- Q; Z4 z+ c) R; D  i& w
, ]9 j% |8 ?7 y/ O% w( ~这样子可以做出来吗？条带好不好看啊~~很期待

YYQ6301

我们两种处理方法，一个是离心去沉淀，一个是煮好后保存