miRNA模拟物的转染体系与步骤

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
  V: z$ O) v+ Q7 K* I! t9 dA. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
8 v) w* }% Y7 `9 d/ jB. siRNA-RFect混合物准备：
6 O+ _8 z' s9 |6 _5 _6 `1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。, |! h2 L* y) w% P7 ?
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。! O3 u$ D9 t$ J+ m5 i' _' D5 F
3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。) M9 c& a  J3 y# G& H
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：+ d! r# T% f4 U
1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。
) a+ `7 J+ E. F- |9 Q' a$ a2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、  V2 M9 l6 k1 i; l; J
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。